近年来,地方品种鸡在我国家禽市场中所占比例不断增多,而广西又是地方品种产量最高、资源最丰富的省份之一。本课题组连续多年监测广西多家大型地方品种种鸡公司全生产链沙门氏菌（Salmonella）污染情况,证实了Salmonella在全生产链各环节中存在广泛而严重的污染/感染,特别是鸡白痢沙门氏菌（Salmonella pullorum,SP）。所以Salmonella的有效防控就是养殖业当前至关重要的一项任务。目前,抗生素仍然是养殖业中防控Salmonella感染的主要手段,但随着使用频率的增多以及不规范使用,容易诱导细菌产生耐药及多重耐药（Antimicrobial multi-resistance,AMR）,使得通过药物防控的措施越来越难以奏效。同时,细菌耐药的产生速度远超新抗生素的研发速度,且随之而来的抗生素残留、耐药基因（Antimicrobial resistant genes,ARGs）转移等问题也给人与动物的健康留下了安全隐患。因此,研究Salmonella的AMR机制就显得意义重大。群体感应（Quorum sensing,QS）系统是细菌通过合成、分泌信号分子（自诱导分子,Autoinducer,AI）来传递信息调控细菌群体行为的普遍机制。当AI浓度达到一定阈值时,某些特定基因的表达就会被启动,其中就包括调控耐药外排泵、生物被膜（Biofilm,BF）等非特异性的耐药机制来提高细菌耐药。Lux S/AI-2型是革兰阴性和阳性细菌最常见的调控细菌耐药与毒力的QS系统,但针对于Lux S/AI-2型QS系统是如何调控SP的Acr AB-Tol C外排泵的机制,目前还不清楚。因此,本研究以课题组前期在地方品种鸡种鸡生产不同环节获得的优势Salmonella即SP的分离株为研究对象,分析其耐药性的演变,并利用转录组测序（Ribonucleic Acid sequence,RNA-seq）分析其可能的耐药机制;同时以QS系统如何调控SP形成AMR为科学问题导向,通过Lux S/AI-2型QS系统这一线索,系统地研究SP的Lux S/AI-2型QS系统中关键分子Lux S、AI-2和Lsr R对外排泵Acr AB-Tol C调控基因与蛋白的作用机制;同时以抑制QS信号表达为理论基础进行药物的筛选与验证。通过探索当前SP分离株AMR的形成机制,为研发新型抗菌药物提供依据,为地方品种鸡养殖业中当前危害最大之SP感染的有效防控提供新的思路。课题首先对广西多个地方品种的种鸡公司获得的583株Salmonella分离株进行耐药表型及其携带ARGs的检测,分析菌株耐药表型和其携带ARGs的符合率;同时检测菌株的外排泵基因及BF基因以及体外形成BF的能力,并将SP的非AMR株和AMR株进行RNA-seq的比较分析,推测其可能的耐药机制。结果表明,583株不同血清型的Salmonella分离株均呈现不同程度的耐药,而且高达98.11%（572/583）的菌株呈现AMR,随着时间的推移,耐药谱型由“宽和少”向“窄和多”演变,如绝大部分菌株均呈现AMP-AMC-TMP-SIZ-SXT-NAL等耐药谱型,说明现场分离株由之前的广泛性耐药演变成现阶段的相对集中耐药。对不同时间不同血清型的216株分离株携带的ARGs检测发现,阳性率最高的是par C（92.91%）,其次是gyr A（92.12%）、blaTEM-1（72.22%）、aph（3）-Ia（68.06%）、tet M（43.06%）和tet A（32.41%）。另外还有个别基因(tet B、tet G、sulⅢ、dfr12、aad A1、aad B、intⅠ2、intⅠ3、tnp U和blaCTX-M)在2018年未曾检测到,但在2019或者2020年才有检出,尽管阳性率都还比较低。Salmonella分离株携带喹诺酮类ARGs与其耐药表型的符合率较高,在2019年甚至达到100%。β-内酰胺类逐年上升至90.32%;而四环素类的符合率则呈现下降趋势（由94.11%下降至62.50%）,磺胺类（29.30%）和氨基糖苷类（66.27%）的整体符合率并不高。说明分离株对除了喹诺酮类抗生素以外的抗生素的耐药机制并非都是由特异性ARGs主导,可能存在其他的耐药机制;同时,对SP分离株外排泵基因和BF基因的检测发现其阳性率均高达90%以上,同时分离株具有强的体外BF形成能力;RNA-seq分析表明,AMR株与非AMR株的差异表达基因主要富集在细胞膜及其组件、生物过程、能量代谢、信号转导、膜转运等代谢途径,且其外排泵基因acr A（上调1.67倍）、acr B（上调2.24倍）及其调控基因sox S（上调2.06倍）、sox R（下调2.71倍）的表达量均发生显著性变化,而BF基因则差异不显著。提示这些SP的AMR机制涉及了非特异性耐药机制中的主动外排。为了探讨SP外排泵介导的非特异性耐药及其调控机制,课题基于QS系统来探索外排泵Acr AB-Tol C对其AMR的调控作用。研究首先构建了SP的QS系统lux S基因的缺失株,然后检测lux S基因缺失株的生长曲线、耐药表型、外排泵调控基因的转录水平及蛋白表达水平,最后利用表面等离子共振技术（Surface plasmon resonance,SPR）分析Lux S蛋白与外排泵调控蛋白Sox S和Sox R之间的相互作用。结果表明,lux S基因缺失后,菌株的生长速率未发生显著变化,而对亲本株SP129耐受的AMP、AMC、TMP、SXT、SIZ、NAL等抗生素则表现出敏感,说明lux S基因不影响菌株的生长,但可调控菌株的耐药性。同时,lux S基因缺失导致外排泵sox S基因的转录水平和Sox S蛋白的表达水平均显著下降,sox R基因转录水平和Sox R蛋白表达水平显著提高;以及外排泵基因acr A、acr B的m RNA表达量均显著性降低。这些结果说明QS系统可通过Lux S蛋白来调节外排泵调控基因的转录及其蛋白表达而影响外排泵基因的表达。另外SPR实验表明Lux S蛋白与Sox S、Sox R蛋白之间没有相互作用,说明Lux S蛋白并不是直接作用于外排泵的调控蛋白。以上研究表明,QS系统中关键分子Lux S蛋白可以有效地调控SP的外排泵而改变其耐药性,但不是通过自身直接作用于外排泵调控蛋白而发挥作用,可能存在其他的作用方式。为了研究QS系统中Lux S蛋白的下游信号分子AI-2及其靶蛋白Lsr R对SP外排泵Acr AB-Tol C的调控作用。课题体外合成了信号分子AI-2,并分析了AI-2的浓度、活性及其对菌株生长和耐药性的调节作用,同时利用q PCR检测AI-2对外排泵基因acr A、acr B、tol C及其调控基因sox S和sox R的m RNA转录之作用,以及利用蛋白质印迹法（WB）检测了AI-2对外排泵调控蛋白Sox S和Sox R表达的影响,并通过分子对接技术分析AI-2与蛋白Sox S和Sox R的相互作用。另外通过凝胶迁移实验（Electrophoretic mobility shift assay,EMSA）验证体外表达的Lsr R蛋白与sox S和sox R基因启动子的相互作用。结果表明,在体外合成的信号分子AI-2浓度可以达到300μmol/L,其生物学活性是阳性对照组哈维弧菌BB152的3倍。外源添加AI-2后,菌株的生长速率与未添加组基本一致,但低耐药菌株（1817D23）和中度耐药菌株（SP129）对原本敏感的CTX、CAZ、GEN、AMK、KAN、TET等抗生素表现出了耐药,说明体外合成的具有一定活性及浓度的AI-2不影响菌株的生长,但可影响分离株的耐药性;同时外源添加AI-2后,外排泵基因acr A、acr B及其调控基因sox S的m RNA转录水平显著提高,且蛋白Sox S的表达量也显著提高,但sox R的m RNA转录与蛋白Sox R的表达量则无显著变化;另外,通过分子对接技术分析可知AI-2可与蛋白Sox S和Sox R相结合,两者的关键氨基酸残基可形成多个氢键,说明AI-2可以通过与Sox S蛋白相结合而调控外排泵sox S基因的转录和蛋白Sox S的表达,从而促进外排泵基因的表达;此外,EMSA结果显示,Lsr R蛋白与sox S和sox R基因的启动子之间没有结合,说明AI-2的靶蛋白Lsr R不能与sox S和sox R基因之间直接相互作用。以上研究结果表明,信号分子AI-2可以通过与Sox S蛋白的结合,增强sox S基因的转录水平和Sox S蛋白的表达水平,从而促进外排泵基因的表达来增强菌株的耐药性。为了探索通过抑制QS系统信号分子AI-2的表达来有效的控制SP的AMR,本研究以AI-2的合成蛋白Lux S为靶标,利用分子对接技术筛选能够抑制Lux S蛋白表达的中药单体分子,并进行分子动力学分析;同时利用筛选的中药单体分子进行体外抑菌实验及与抗生素的联合抑菌作用,并通过q PCR检测中药单体分子对SP lux S基因m RNA转录水平的影响,利用WB检测中药单体分子对Lux S蛋白表达水平的影响,并测定AI-2的活性。实验结果显示,根据结合能大小、中药单体分子的溶解性、应用广泛性、价格等因素,最终选定具有与Lux S蛋白多个氨基酸残基形成氢键及疏水作用力的中药单体甘草酸（Glycyrrhizic acid,GA）作为Lux S蛋白表达的抑制剂;体外抑菌试验显示,32 mg/m L GA可有效抑制Salmonella SP129的生长,说明GA有一定的抑菌能力。亚抑菌浓度的GA可以显著抑制lux S基因m RNA的表达和Lux S蛋白的表达及AI-2的活性及外排泵基因acr A和acr B的表达,且呈现剂量依赖性;另外,GA与AMC、CTX、SIZ、CIP四种抗生素进行联合应用均表明有协同抑菌作用。以上研究的结果表明,GA作为Lux S蛋白表达抑制剂可与抗生素联合应用产生了协同抑菌作用,有效地降低SP的耐药性,具有研发成为抗菌增效剂的潜质。本课题研究的结果表明,2018-2020年广西地方品种鸡源Salmonella分离株表现AMR并非都是由特异性ARGs主导,而可能与外排泵介导的非特异性耐药机制有关;同时证明QS系统中关键分子Lux S蛋白可以通过其下游信号分子AI-2与外排泵Acr AB-Tol C调控蛋白Sox S的结合,增强sox S基因的转录水平及Sox S蛋白的表达水平,从而促进外排泵基因acr A、acr B的表达来增强SP的耐药性。此外,GA可作为QS系统抑制剂通过与Lux S蛋白结合,并抑制其表达及AI-2的活性,从而与抗生素联合应用产生协同抑菌作用,有效地降低SP的耐药性。