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目的:构建实时荧光定量PCR方法快速检测临床常见病原细菌并初步做细菌革兰氏分类鉴定,为无菌部位细菌感染患者提供快速病原学诊断实验室信息。方法:选择细菌16sRNA基因作为靶基因,设计适合实时荧光定量PCR技术的细菌通用引物和能区分革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的探针。并对探针进行双色标记。定性PCR方法验证引物和探针的特异性和通用性。优化双色实时荧光定量PCR实验反应体系和扩增条。用11种标准菌株、19种临床分离菌株、乙型肝炎病毒、新型隐球菌、白色念珠菌以及人基因组DNA进行方法特异性分析。用细菌培养菌落计数方法获得细菌浓度并稀释后做方法的敏感性和检测线性分析。结果:用所设计的引物进行定性PCR检测,5种临床分离菌菌株均得到扩增产物,而对乙型肝炎病毒、新型隐球菌、白色念珠菌以及人基因组DNA未检测到扩增产物。用优化后的双色实时荧光定量PCR上述11种标准菌株及19种临床分离菌菌株和乙型肝炎病毒、新型隐球菌、白色念珠菌、人基因组DNA,14株革兰氏阳性细菌的G+探针PCR检测均为阳性,Ct值在17.0——23.0之间,G-探针PCR检测均为阴性。16株革兰氏阴性细菌G-探针PCR检测均为阳性,Ct值结果在11.0——23.0之间,G+探针PCR检测均为阴性。乙型肝炎病毒、新型隐球菌、白色念珠菌以及人基因组DNA检测均为阴性。方法最低可检测到35个大肠杆菌/ml和100个金黄色葡萄球菌/ml。结论:1、本研究中所设计的PCR引物和探针序列对临床常见分离细菌具有细菌特异性和通用性,可用于快速检测细菌的PCR方法的建立。2、本研究所构建的双色实时荧光定量PCR检测方法对临床常见分离细菌的检测具有较好的特异性和敏感性。3、本研究所构建的双色实时荧光定量PCR检测方法具有简便、快速和成本相对较低的特点,具有临床推广应用的较好前景。