论文部分内容阅读
溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)是一种慢性非特异性炎症肠病,主要侵害直肠、结肠黏膜及黏膜下层。针刺疗法效果明确、不良反应少,在临床上广泛应用于胃肠道疾病治疗;美沙拉嗪是一种氨基水杨酸类抗炎药物,常用于炎症性肠病的治疗。本研究基于TNBS/乙醇结肠灌注法诱导的大鼠UC模型,探讨了电针联合美沙拉嗪治疗UC的效果及其作用机制,以期为人或动物UC的防治提供参考。研究方法:(1)60只雄性Wistar大鼠随机分6组(10只/组),分别为空白组(Control)、1周组(W1)、2周组(W2)、3周组(W3)、4周组(W4)、5周组(W5)。采用舒泰水溶液腹腔注射麻醉,除Control组外,其它组大鼠均在结肠一次性灌注50 mg/kg的TNBS乙醇溶液,并分别于造模后第7天、14天、21天、28天、35天麻醉大鼠并取样。试管定量显色基质法测定血浆中内毒素的含量;对结肠进行形态组织学评分;HE染色法观察结肠病理学变化;免疫荧光法检测结肠组织紧密连接蛋白Claudin-1、ZO-1的表达;ELISA法检测结肠组织TNF-α IL-1β、IL-10的蛋白表达;化学发光法检测结肠组织SOD、GSH-Px活性和MDA含量;通过16SrRNA高通量测序技术,对大鼠结肠肠道菌群进行测序分析。(2)60只雄性Wistar大鼠随机分为6组(10只/组),分别为空白组(Control)、模型组(TNBS)、电针组(TNBS+EA)、美沙拉嗪组(TNBS+ME)、电针联合美沙拉嗪组(TNBS+EA+ME)、假针组(TNBS+SA)。采用舒泰水溶液腹腔注射麻醉,除Control组外,其它组大鼠均在结肠一次性灌注50 mg/kg的TNBS乙醇溶液,并于造模第4天开始进行治疗。Control、TNBS组大鼠每日给予20min保定刺激;TNBS+EA组大鼠于左侧足三里、曲池穴给予电针刺激(疏密波,2~4mA,8Hz/25 Hz),20 min/次,隔日一次,共5次;TNBS+ME组大鼠每日灌服500 mg/kg的美沙拉嗪生理盐水混悬液1次,连续10天;TNBS+EA+ME组大鼠同时给予相同的口服美沙拉嗪、电针刺激;TNBS+SA组大鼠于左侧足三里、曲池穴外侧平行旁开0.5 cm处给予电针刺激。5次针刺治疗结束后隔天采样,对结肠进行形态组织学评分;HE染色法观察结肠病理学变化;扫描电镜观察结肠黏膜超微结构变化;免疫荧光法检测结肠组织紧密连接蛋白Claudin-1、ZO-1的表达;多色流式细胞术检测肠系膜淋巴结淋巴细胞CD3+、CD4+、CD8+亚群的含量;RT-qPCR法检测结肠组织TNF-α、IL-1β、IL-10的mRNA表达;化学发光法检测结肠组织SOD、GSH-Px活性和MDA含量;通过16SrRNA高通量测序技术,对大鼠结肠肠道菌群进行测序分析;ELISA法检测下丘脑中5-HT、MT、GABA含量;ELISA法检测结肠组织中5-HT、HIS、β-EP含量;Western Blot法检测结肠组织p-P65、p-IκBα及ERS信号通路关键蛋白表达。试验结果:(1)较Control组:血浆中内毒素在W1组显著升高(P<0.05);W1、W2、W3组大鼠结肠粗大,肠壁变薄、出血,W4组肿胀改善,W5组无明显肿胀、出血。W1组结肠黏膜细胞排列紊乱,大量炎性细胞浸润并伴有充血;W2组结肠黏膜开始修复,但W5组结肠黏膜中仍存在少量炎性细胞。W1、W2、W3组结肠组织中IL-1β、MDA含量显著升高(P<0.05),IL-10、SOD、GSH-Px含量显著降低(P<0.05);W4、W5组结肠组织中IL-1β、TNF-α、MDA含量差异不显著,W5组结肠组织中IL-10、SOD、GSH-Px含量仍显著降低(P<0.05)。W1-W5组大鼠肠道菌群的多样性及丰度均显著降低(P<0.05);W1与W5组、W3与W4组结肠菌群相似性高;W2组F/B比值显著升高(P<0.05)。(2)较TNBS组:TNBS+EA+ME组大鼠死亡率明显降低,UC临床症状明显减轻,其作用效果优于TNBS+EA、TNBS+ME、TNBS+SA组。TNBS+EA+ME组大鼠结肠组织炎性细胞浸润及杯状细胞破坏明显减轻,结肠黏膜Claudin-1、ZO-1的表达明显升高;肠系膜淋巴结中CD4+/CD8+比值显著升高(P<0.05);结肠组织中NF-κB、ERS信号通路活性显著降低(P<0.05);结肠组织中促炎因子(TNF-α、IL-1β)、氧化产物MDA的含量均显著降低(P<0.05),抑炎因子(IL-10)、氧化还原酶(SOD、GSH-Px)的含量均显著升高(P<0.05);结肠组织中致痛物质5-HT、HIS含量显著降低(P<0.05),镇痛物质β-EP含量显著升高(P<0.05);下丘脑中MT、GABA含量显著升高(P<0.05);肠道菌群多样性与丰度以及有益菌的数量均明显改善。结论:TNBS/乙醇结肠灌注法诱导的大鼠UC在第1-2周为急性炎症期,第3-5周为慢性炎症期;电针联合美沙拉嗪可通过调节肠道免疫、促进黏膜修复、改善肠道菌群、抑制炎症等方面有效治疗TNBS诱导的大鼠UC,二者具有协同作用。