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骨骼肌是一种高度异质的组织,约占机体体重40%,由肌纤维、肌膜、肌卫星细胞和神经组成。作为一种异质组织,骨骼肌由两种类型的纤维组成,即I型和II型肌纤维。这两种类型的纤维具有不同的糖脂代谢途径,前者富含线粒体,主要依靠有氧代谢获得能量,而后者主要依靠无氧糖酵解获得能量。同时,肌纤维的类型和组成比例也影响着肉产品的质量,包括感官评分和营养评分。长链非编码RNA(lnc RNA)是被定义为长度范围为200 nt到100 kb的RNA,它们通过类似于m RNA的机制转录,但缺乏显著的蛋白质编码潜力。已有研究发现lnc RNA在多种生物过程中发挥功能,包括调节细胞生长、增殖分化和凋亡、组织和器官发育。然而,有关调控动物骨骼肌肌纤维类型转化的lnc RNAs还亟需被鉴定,其相关机制也有待进一步研究。实验室前期研究发现腺相关病毒(Adeno-associated virus AAV)介导的lnc-ORA在小鼠体内过表达后,小鼠的肌肉组织在颜色、大小上均表现出差异变化。同时发现lnc-ORA在快肌纤维中的表达显著高于慢肌纤维,表明lnc-ORA可能具有调控肌纤维类型转化的潜在功能。因此,本研究以成肌细胞、猪肌卫星细胞和CRISPR/Cas9系统构建的lnc-ORA敲除小鼠作为研究对象,通过过表达、干扰以及基因敲除的研究手段,运用代谢笼实验、小鼠耐力实验、胰岛素与葡萄糖耐受实验、荧光双标、HE染色、线粒体及酶活检测等技术方法,在细胞、分子和活体水平探究lnc-ORA在调控骨骼肌肌纤维类型组成的作用及分子机制。获得的主要结果如下:1.敲除lnc-ORA促进肌肉生长。利用CRISPR/Cas9系统成功构建了lnc-ORA敲除小鼠(lnc-ORA-KO)。与野生型小鼠(WT)相比,lnc-ORA-KO鼠的体重降低,脂肪组织的重量显著下降。然而肌肉组织如腓肠肌(GAS)和趾长伸肌(EDL)的重量显著上升,同时腓肠肌肌纤维的横截面积显著增大。2.敲除lnc-ORA促进快肌纤维向慢肌纤维转化。lnc-ORA在快肌(趾长伸肌)中的表达显著高于慢肌(比目鱼肌)。与WT鼠相比,KO鼠腓肠肌中慢肌纤维比例显著升高,快肌纤维比例减少。KO鼠比目鱼肌的横截面积要大于WT鼠。KO组小鼠GAS中慢肌相关基因的表达均显著高于WT组。同时,lnc-ORA-KO鼠骨骼肌中的琥珀酸脱氢酶(Succinate dehydrogenase,SDH)活性显著高于WT组,乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)活性低于WT组。敲除lnc-ORA后骨骼肌中线粒体呼吸链复合物相关蛋白CIII-UQCRC、CII-SDHB、CI-NDUFB8表达量升高,编码线粒体呼吸链复合物的相关基因Ndufa1、Ndufs4、Ndufaf4、Sdhd、Cox7a1、Atp5e上调。除此之外,与WT小鼠相比,lnc-ORA-KO鼠表现出更强的运动耐力。3.lnc-ORA敲除鼠糖脂代谢能力增强。葡萄糖耐受实验(Glucose tolerance test,GTT)显示,与WT鼠相比,KO鼠对葡萄糖的代谢能力更强,KO鼠和WT鼠的血清中胆固醇和乳酸脱氢酶存在显著差异。同时,敲除lnc-ORA后小鼠骨骼肌中的葡萄糖糖转运相关基因Glu1表达量上升,脂肪酸氧化、摄取和利用基因Cpt1a、Cpt1b、Acads表达量显著上调。代谢笼实验显示,lnc-ORA-KO鼠比WT鼠具有更高的耗氧量和热值和更低的呼吸熵,热成像显示lnc-ORA-KO鼠的体表温度显著高于WT鼠。4.lnc-ORA可能通过与PKM互作促进成肌细胞快慢肌转化。lnc-ORA增加了成肌细胞中快肌肌管生成,抑制慢肌肌管生成。同时,快肌分化相关标志蛋白Fast-My HC表达水平升高,且快肌收缩相关基因Tnni2与Tnnt3表达水平上升。慢肌分化相关标志蛋白Slow-My HC的表达水平下降,慢肌收缩相关基因Tnni1与Tnnt1的表达下调。调控快肌纤维向慢肌纤维转化的基因PGC-1α的表达显著下降。机制方面,lnc-ORA可以吸附蛋白PKM来促进成肌细胞中快慢肌肌管的转化。5.外源性过表达lnc-ORA促进猪肌卫星细胞中快肌纤维分化。免疫荧光结果显示外源性过表达lnc-ORA促进猪肌卫星细胞中快肌纤维的生成。同时,快肌纤维分化相关蛋白Fast-My HC表达水平升高,快肌收缩相关基因Tnni2、Tnnt3的表达水平显著上升。综上所述,本研究证明了lnc-ORA的功能性缺失可以促进骨骼肌中快肌纤维向慢肌纤维的转化以及骨骼肌线粒体生物发生,并且促进小鼠骨骼肌的糖脂代谢和全身能量代谢。同时还发现lnc-ORA的过表达促进C2C12成肌细胞和肌卫星细胞中快肌肌管的形成。本研究结果为改良猪肉品质提供了一个新的侯选靶标。