论文部分内容阅读
蓝藻是地球上分布最广泛、最原始的放氧光合作用原核生物,在适宜水体中会大量生长繁殖,形成蓝藻水华。蓝藻的光合作用是从藻胆蛋白组成的藻胆体结构吸收光能开始的。藻胆蛋白是一个多亚基组成的蛋白复合物,每个亚基上结合不同的开环四吡咯色素分子(色基),使得它们可以吸收不同波长的光能。蓝藻体内,藻胆色素与脱辅基藻胆蛋白的正确连接一般都需要特异的裂合酶来催化完成。目前已发现裂合酶CpcE/F催化脱辅基蛋白CpcA与藻蓝色素PCB的连接,裂合酶PecE/F催化PCB异构为PVB并与脱辅基蛋白PecA连接,裂合酶CpeS1不仅催化PCB与CpcB和PecB的Cys-84位连接,同时也能催化PCB与脱辅基蛋白ApcA、ApcB、ApcA2、ApcD、ApcF的连接。裂合酶CpeTl能催化CpcB和PecB的β亚基Cys-155位与藻蓝色素PCB的偶联。本文以原核生物蓝藻PCC 7421藻红蛋白(CPE)为研究对象,首先研究了CPE的生物合成。本文以已知的有活性的裂合酶进行同源搜索,找出了20个可能的裂合酶。利用共表达载体,将CPE脱辅基亚基CpeA或CpeB、合成色基的血红素氧化酶HO1、氧化还原酶PebA、PebB及可能的裂合酶在大肠杆菌中共同表达。在裂合酶CpeY的催化作用下,大肠杆菌能够利用自身的亚铁血红素合成具有与天然CPEα亚基一致的特征吸收和荧光光谱的重组色素蛋白holo-CpeA。裂合酶CpeS2对CpeB和PEB的共价结合有一定的催化活性。Zhao等发现来自鱼腥藻PCC7120的裂合酶CpeSl能催化丝状蓝藻PCC7601中藻红蛋白α亚基Cys-82位和β亚基Cys-80位与藻红胆素PEB的偶联。无类囊体蓝藻PCC7421和丝状蓝藻PCC7601中的CPE有极高的同源性,我们将脱辅基蛋白替换为PCC7601中的CpeA(C82A)、CpeB(C80S/C165S)和CpeB(C48A/C59S/C80S)进行体内重组,但是未能找到有催化活性的酶或酶的组合。植物光敏色素是一种重要的光受体,蓝细菌光敏色素是发现于蓝藻内的一种藻胆色素蛋白,其蛋白质结构与植物光敏色素有较高的同源性,生理功能上与植物光敏色素也有很大的相似性,在蓝藻内起着光信号受体的作用。蓝细菌光敏色素分子结构相对简单、易于进行分子设计,是研究光敏色素分子功能、生理机制的优良模型。本文以来自Anabaena sp. PCC 7120的aphC基因及其编码蛋白AphC为对象,对蓝细菌光敏色素AphC及其GAF结构域的体内重组和体外重组及其作用机制进行了研究。首先采用聚合酶链式反应方法从鱼腥藻Anabaena sp. PCC 7120,总DNA中克隆出完整的aphC,同时通过同源性分析,构建了以下aphC的4个定点突变体对其功能区域及功能氨基酸残基进行了分析,即：aphC(C138L), aphA(C478A), aphA(C554L)和aphA(C138L/C554L)。将这些基因片段构建入表达载体pET-30a(+)中,含目的基因的表达载体、血红素氧化酶HO1和胆绿素还原酶PcyA同时转入大肠杆菌体内共表达。根据重组产物的光谱特征峰分析,发现色素蛋白PCB-AphC显示出两种独立的可逆光致变色效应。AphC中具有两个独立的可结合色素的GAF结构域,分别是GAF1结构域和GAF3结构域。将单独的GAF1和GAF3分别与PCB重组得到的产物也可以分别显示出一种与PCB-AphC一致的可逆光致变色效应。实验证明PCB-GAF1在700nnm和570nm光照条件下分别表现为红光吸收(λmax=636nm, Pr)和远红外光吸收(λmax= 684nm, Pfr), PCB-GAF3在700nm和>610nm光照条件下分别表现为红光吸收(λmax= 644nm, Pr)和橙光吸收(λmax=584nm, Po)。色素蛋白经酸性尿素变性后,紫外吸收峰值在662nm左右,表明所连接的色素为藻蓝色素PCB。色素蛋白的蛋白质电泳经醋酸锌染色后,在紫外光照射下发出锌荧光,证明色素与蛋白的连接方式为共价偶联。利用光谱数据可计算得到色素蛋白的荧光量子产率、摩尔消光系数等。PCB-GAF3的橙光吸收(Po)在黑暗条件下会快速的自发转化为红光吸收(Pr),PCB-GAF1的远红外光吸收(Pfr)在黑暗条件下会缓慢的转化为红光吸收(Pr)。在-77K低温状态下,可以测得PCB-GAF3的橙光吸收型完整的荧光光谱。色素蛋白PCB-AphC、PCB-AphC(C138L)和PCB-AphC(C554L)经纯化后测圆二色谱,在紫外光区的圆二色谱显示出α-螺旋结构。AphC在C端有组氨酸激酶结构域,实验证明色素蛋白PCB-AphC的自磷酸化与其可逆光致变色相关,在红光吸收(Pr)下发生的自磷酸化程度较弱。