口腔扁平苔藓（Oral lichen planus,OLP）是一种发生在口腔黏膜的慢性免疫炎性疾病,其免疫发病机制包括抗原提呈,T细胞活化、增殖、凋亡、迁移,角质形成细胞凋亡。目前OLP的病因仍不明确,但大量研究已证实OLP与T细胞介导的免疫应答有关。外泌体是由细胞内多囊泡体与细胞膜融合而分泌到细胞外的脂质双分子层结构囊泡,广泛存在于外周血、尿液、乳汁等各种体液中。外泌体含有丰富的蛋白质、核酸等生物活性分子,携带和传递重要的信号分子,介导细胞间的信息传递,调控细胞的生理病理过程。越来越多的研究发现外泌体具有免疫调控功能,在多种免疫炎性疾病中发挥重要作用。外泌体参与调控T细胞的活化、增殖、凋亡、迁移等过程,导致T细胞的功能异常及生物学特性发生改变。外泌体在OLP中的作用尚不明确,本课题拟分为四个部分探讨循环外泌体在OLP T细胞介导的免疫炎性反应中的作用及机制。第一部分循环外泌体提取方法比较目的:外泌体的分离提取方法种类繁多,目前尚缺乏一个金标准。本实验对三种血浆外泌体的提取方法进行比较,筛选出最佳方法,为后续实验研究奠定基础。方法:收集人外周血血浆,分别采用膜亲和法、超速离心法、聚合物沉淀法三种方法分离提取循环外泌体。运用透射电镜观察外泌体形态,纳米粒度分析仪及q Nanosight检测外泌体粒径大小,流式细胞术和western blot检测外泌体表面标志物分子CD9和CD63的表达,BCA法和Nanodrop 2000分别比较外泌体蛋白总质量及RNA含量。结果:三种提取方法证实血浆中存在直径为100 nm左右的膜性微囊泡,呈典型的杯口状结构。经流式细胞术和蛋白质印迹检测证实这些膜性囊泡表达外泌体标记蛋白分子CD9及CD63。膜亲和法提取的外泌体粒径分布均匀,呈单峰结构。膜亲和法和超速离心法提取的外泌体蛋白含量、RNA含量之间无明显差异。而聚合物沉淀法提取的外泌体血浆白蛋白、总蛋白含量最高,而RNA含量最低,与其它两种方法相比均具有显著差异。结论:膜亲和法、超速离心法和聚合物沉淀法三种方法都能够成功提取循环外泌体,但超速离心法和膜亲和法获得的外泌体纯度更高,更适用于后续实验研究。第二部分循环外泌体调控口腔扁平苔藓T细胞介导的免疫炎性反应目的:外泌体具有免疫调控功能,参与调节T细胞的活化、增殖、凋亡、迁移等过程,影响T细胞免疫炎性功能。本实验主要研究OLP循环外泌体在T细胞介导的免疫炎性反应中的作用。方法:从OLP患者及正常对照组中分离提取外泌体。将T细胞与不同浓度PKH67标记外泌体共培养0 h、12 h、24 h、48 h,共聚焦显微镜下观察T细胞对外泌体的摄取情况。CCK8、流式细胞术及transwell小室分别检测外泌体对T细胞增殖、凋亡及迁移的影响。ELISA检测外泌体作用后T细胞IL-2、IL-4、IL-10及IFN-γ的分泌水平。结果:T细胞能够摄取PKH67标记的外泌体,呈时间和剂量依赖性。OLP循环外泌体不能活化T细胞。与正常对照组相比,糜烂型OLP循环外泌体能够显著促进T细胞增殖,减少T细胞凋亡,促进T细胞迁移。糜烂型OLP循环外泌体促进T细胞分泌IFN-γ,非糜烂型OLP循环外泌体抑制T细胞分泌IL-4。结论:OLP循环外泌体影响T细胞的生物学特性,诱导T细胞炎性细胞因子分泌失调,可能参与OLP的发病机制。第三部分口腔扁平苔藓循环外泌体差异miRNAs的筛选目的:MiRNAs参与调控T细胞的生理病理过程,在OLP T细胞免疫应答中发挥举足轻重的作用。外泌体介导的miRNAs在细胞间的生物信息传递过程中起着重要作用,在多种疾病中存在外泌体miRNAs表达异常。本研究筛选OLP循环外泌体差异表达的miRNAs,分析差异表达miRNAs与OLP分型及RAE计分的相关性。方法:提取OLP及正常对照组外泌体、血浆及外周血T细胞总RNA。运用mi Script?miRNA PCR Array微阵列筛选循环外泌体异常表达的miRNAs,再利用q RT-PCR对微阵列中筛选出的差异表达miRNAs进行验证。分析外泌体miRNAs与RAE计分之间的相关性。采用生物信息学方法预测外泌体差异表达miRNAs的靶基因和通路。结果:与正常对照组及非糜烂型OLP相比,糜烂型OLP循环外泌体miR-34a-5p和miR-130b-3p的表达显著上调,而miR-301b-3p表达显著下调。与正常对照组相比,非糜烂型OLP循环外泌体miR-34a-5p和miR-130b-3p表达显著上升,循环外泌体miR-301b-3p表达显著下降。此外,OLP血浆及外周血T细胞miRNA-34a-5p均显著增高。OLP循环外泌体及T细胞miR-34a-5p表达水平与RAE呈正相关关系。生物信息学分析结果显示miR-34a-5p的靶基因可能通过PI3K/AKT信号通路主要参与基因表达的调控、细胞交流、信号传导以及代谢过程。结论:OLP循环外泌体及T细胞异常表达miR-34a-5p,差异表达的miR-34a-5p可能通过PI3K/AKT信号通路影响OLP病情,可作为OLP潜在的生物标志物。第四部分MiR-34a-5p靶向PI3K/AKT/UCN2信号通路调控T细胞生物学功能目的:miR-34a-5p在免疫系统中发挥重要调控作用,参与各种免疫细胞的发育、功能及存活等。本研究主要探索miR-34a-5p是否通过PI3K/AKT信号通路调控T细胞的增殖及凋亡。方法:使用miR-34a-5p mimics、miR-34a-5p inhibitors、miR-34a-5p NC慢病毒感染T细胞,构建T细胞稳转株。CCK8、western blot和流式细胞术检测miR-34a-5p对T细胞增殖和凋亡的影响。运用q RT-PCR验证miR-34a-5p靶基因预测结果。利用miRanda在线工具及双荧光素酶报告基因系统检测miR-34a-5p与其靶基因UCN2 3’UTR区域结合位点。Western blot检测下游信号通路蛋白表达情况。结果:与NC组相比,mimics组T细胞增殖能力明显增强,凋亡显著减少,而inhibitors组T细胞增殖能力明显降低,凋亡显著增加。MiR-34a-5p靶向调控T细胞UCN2 3’UTR区域。T细胞PI3K、p-AKT、UCN2蛋白表达的水平随着miR-34a-5p表达的增高而逐渐降低。结论:MiR-34a-5p靶向抑制PI3K/AKT/UCN2信号通路,调控T细胞增殖和凋亡,提示其可能参与了OLP的发生发展。