[目 的]验证不同亚型的人乳腺癌细胞中人表皮生长因子受体-2（Human Epidermal Growth Factor Receptor 2,HER-2）、上皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR）蛋白的表达水平,研究HER-2、EGFR蛋白的表达量与曲妥珠单抗介导的抗体依赖性的细胞介导的细胞毒作用（Antibody-dependent Cell-mediated Cytotoxicity,ADCC）之间的相关性;在此基础上,进一步研究自然杀伤（Natural Killer,NK）细胞比例增加对曲妥珠单抗所介导的ADCC产生的影响;探索加入曲妥珠单抗后达到ADCC峰值的反应时间;以及在加入曲妥珠单抗后间隔不同时间加入帕妥珠单抗,对其介导的ADCC效应影响差异,旨在探索乳腺癌临床治疗的更多辅助治疗手段,探讨增强临床双靶用药获益的更多可能。[方 法]1.培育不同亚型的人乳腺癌细胞,提取总蛋白,利用Western Blot对不同样本中HER-2、EGFR蛋白的含量进行测定,根据HER-2蛋白的表达量选择过表达及低表达的细胞株。2.利用密度梯度离心法,从健康成年人全血中分离、提取外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells,PBMCs）。3.使用磁珠分离法,从PBMCs中提取、纯化NK细胞,以选择CD56+的NK细胞。培育人髓系白血病细胞K562,与分离纯化后的NK细胞共培养,使用流式细胞术,测定NK细胞杀伤力。4.将纯化后的NK细胞与各亚型的乳腺癌细胞株按不同比例共孵育,加入等量曲妥珠单抗,使用流式细胞术,测定不同NK细胞与靶细胞比例下的ADCC差异。5.在一定范围内,改变曲妥珠单抗的加药浓度,使用流式细胞术测定对HER2阳性乳腺癌细胞株的ADCC效应影响;测定加入曲妥珠单抗后,不同反应时间的ADCC效应差异,探索达到ADCC峰值的反应时间。6.在HER-2阳性乳腺癌细胞株中加入曲妥珠单抗后,间隔不同时间加入帕妥珠单抗,使用流式细胞术检测其对曲妥珠单抗介导的ADCC效应的影响差异,以及对达到ADCC峰值时间的影响。[结 果]1.Western Blot 结果显示,HER-2、EGFR 蛋白在 SK-BR-3、BT-474 细胞株中均为高表达,MDA-MB-231、MCF-7细胞株中无表达或低表达、K562细胞株中无表达。2.分离纯化后的NK细胞与分离前的PBMCs对比,细胞纯度增加,CD56+的NK细胞占比明显增多。3.不同健康成年人的NK细胞杀伤能力不一,存在个体间差异。4.当NK细胞与靶细胞比例增高时,在各亚型乳腺癌细胞株中,ADCC效应均随之增加,但加入曲妥珠单抗后HER-2阳性乳腺癌细胞株中的ADCC效应增强,较HER-2阴性乳腺癌细胞株显著。在MDA-MB-231细胞株中,ADCC效应或受到抑制。5.在一定范围内,改变曲妥珠单抗的浓度对ADCC的影响差异较小。6.添加曲妥珠单抗,作用4-24h,在24h时达到ADCC峰值。7.当曲妥珠单抗与帕妥珠单抗的浓度为1:1时,杀伤比例较1:2稳定。8.加入曲妥珠单抗后,间隔1h内加入帕妥珠单抗,在共同作用12h时,杀伤比例显著增高,作用20h时达到杀伤比例峰值。9.在加入曲妥珠单抗后24h测定结果,间隔0h、4h、8h、12h、16h、20h加入帕妥珠单抗,间隔8h、作用16h时达到杀伤比例峰值,较单独加入曲妥珠单抗的实验组提前8h,其杀伤比例峰值与间隔1h内加入帕妥珠单抗组的杀伤比例峰值接近。[结 论]在HER2阳性或阴性的人乳腺癌细胞中,加入不同比例经IL-2刺激的CD56+NK细胞,杀伤比例随加入的NK细胞比例增加而增强;当效应细胞与靶细胞比例为9:1时,加入曲妥珠单抗,在HER-2阳性的人乳腺癌细胞株中得到的杀伤比例显著高于阴性;以增加NK细胞数量、刺激NK细胞增殖以及改善NK细胞功能为目的的免疫治疗,或能成为HER-2阳性乳腺癌临床治疗的辅助治疗手段。而随着药物浓度的增加,ADCC效应具有饱和性。由于客观原因的限制,许多患者在临床治疗过程中,往往由于各种因素未能直接进行双靶治疗,有部分患者仅接受了曲妥珠单抗的单靶治疗,有部分患者在接受单靶治疗一段时间后才进行了双靶治疗,这些患者的临床获益是我们想要探索研究的。通过我们的实验发现,对比单独使用曲妥珠单抗的实验组,使用双靶药物的实验组得到的杀伤比例更为稳定、且达到杀伤比例的峰值提前,且实验组间的杀伤比例峰值接近。使用双靶药物的效果要优于仅使用曲妥珠单抗,这一点与临床结论是一致的,而间隔一段时间后加入帕妥珠单抗,与间隔1h内加入帕妥珠单抗相比,其ADCC峰值没有太大差异,或可证明在进行单靶治疗后再接受双靶治疗的患者,其ADCC的获益并不会劣于直接进行双靶治疗的患者。