多不饱和脂肪酸对结直肠癌细胞治疗作用机制的研究

来源 :昆明医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:sun383407949
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[目 的]全球范围内,结直肠癌(CRC)是第三大恶性肿瘤,并且是癌症死亡的第二大原因。在中国,结直肠癌是发病率最高的癌症之一,其发病率和死亡率均较高,早期诊断率低、确诊经过治疗后出现复发及远处转移是导致患者预后差、生存率低的主要原因。手术、放化疗、分子靶向治疗及营养免疫治疗是目前治疗结直肠癌的主要手段,但受多方面因素影响患者总生存期仍有很大提升空间,因此急需探讨新的抗肿瘤药物及其抗肿瘤机制来为防治结直肠癌提供新的思路,前期的研究者研究表明多不饱和脂肪酸(PUFAs)对结直肠癌有抗肿瘤作用,ω-6、ω-3多不饱和脂肪酸(PUFAs)的摄入比例失衡起到关键作用。但是多不饱和脂肪酸在分子水平对结直肠癌局部微环境影响的分子机制尚需进一步研究,为进一步探讨其抗肿瘤分子机制,本研究将分析AA,DHA,和EPA这三种PUFAs对结直肠癌细胞的生物学功能的影响及检测AA,DHA,和EPA对结直肠癌发生发展相关基因表达谱的变化,为结直肠癌的辅助化疗提供理论依据。[方 法](1)分析在结直肠癌细胞中AA,DHA,和EPA对细胞增殖、凋亡、周期、侵袭能力及化疗敏感性的影响。选取结肠癌细胞系HT29、RKO细胞作为研究对象,培养基中添加AA、EPA、DHA、5-FU、OXA作为观察组,PBS液处理作为阴性对照组,分析细胞增殖、凋亡、周期、侵袭能力变化,OXA+AA,OXA+DHA,OXA+EPA联合处理细胞,OXA+PBS作为对照,观察加入PUFAs后肿瘤细胞对化疗敏感性的变化情况。(2)分析基因表达谱改变。AA,DHA和EPA处理细胞后,进行mRNA芯片分析,筛选差异基因。利用生物信息学软件进行GO/KEGG聚类分析和信号通路分析。(3)芯片结果的验证:利用qRT-PCR的方法在RNA水平对AA,DHA和EPA处理后筛选出的主要通路基因进行验证,分析两种PUFA处理之间基因表达的差异及与对照组PBS处理组之间的差异。[结 果](1).CCK-8细胞活力检测中,不同剂量的AA、DHA、EPA和5-Fu、OXA对结直肠癌细胞HT29、RKO的生长均有不同程度的抑制。HT29细胞中未加药干预对照组细胞存活率(100±8.52%)均高于AA(125uM)组48小时细胞存活率(73.92±3.56%),DHA(100uM)组 48 小时细胞存活率(54.06±2.06%),EPA(100uM)组48小时细胞存活率(68.34±3.06%),5-FU(4uM)组48小时细胞存活率(49.71±1.16%),OXA(4uM)组 48 小时细胞存活率(25.34±1.68%),因此HT29经AA、DHA、EPA、5-Fu、OXA干预48小时后,细胞存活率较对照组明显降低,差异有统计学意义(p<0.05)。HT29细胞存活率在单药OXA(0.8uM)组(94.66±7.69%)明显高于 OXA(0.8uM)+AA 组(87.76±6.58%)、OXA(0.8uM)+DHA 组(84.56±5.36%)、OXA(0.8uM)+EPA 组(73.12±4.96%),差异有统计学意义(p<0.05)。RKO细胞中未加药干预对照组细胞存活率(100±9.02%)均高于AA(125uM)组48小时细胞存活率(53.06±2.53%),DHA(100uM)组48小时细胞存活率(76.19±3.66%),EPA(100uM)组48小时细胞存活率(59.52±2.53%),5-FU(4uM)组 48 小时细胞存活率(77.41±4.53%),OXA(4uM)组48小时细胞存活率(66.95±3.72%),因此RKO细胞经AA、DHA、EPA、5-Fu、OXA干预48小时后,细胞存活率较对照组明显降低,差异有统计学意义(p<0.05)。RKO细胞存活率在单药OXA(0.8uM)组(69.05±4.32%)明显高于OXA(0.8uM)+AA组(54.97±3.65%)、OXA(0.8uM)+DHA组(48.82±3.89%)、OXA(0.8uM)+EPA 组(68.09±4.37%),差异有统计学意义(p<0.05)。(2).在细胞周期检测实验中,HT29细胞在经50,100,150uMol/L的AA、DHA、EPA干预后,对照组(未加药干预)G1期细胞比例(63.86±3.86%),AA组G1期比例分别(58.51±2.89%),(54.77±3.12%),(51.52±1.68%);DHA 组分别为(65.38±2.45%),(62.97±3.26%),(56.27±2.58%);EPA 组分别为(60.86±3.89%),(50.97±2.68%),(63.31±3.78%),细胞周期无明显变化,无统计学意义(p>0.05)。RKO细胞在经50,100,150uMol/L的AA、DHA、EPA干预后,对照组(未加药干预)G1期细胞比例(42.49±1.56%)均低于 AA 组(46.38±2.36%),(50.82±3.78%),(52.92±2.56%);低于 DHA 组(44.69±3.46%),(49.27±3.68%),(78.29±5.79%);低于 EPA 组(44.59±3.78%),(49.87±3.69%),(61.03±4.56%),实验组G1期细胞比例均高于对照组,差异有统计学意义(p<0.01)。(3).在细胞凋亡检测实验中,RKO细胞对照组(未加药干预)活细胞比例(94.34±6.97%),当 AA、DHA、EPA(50、100、150uMol/L)分别作用48h后,实验组细胞凋亡比例随浓度升高逐渐增加,其中AA组早凋比例分别为(2.95±0.95%)、(4.66±1.11%)、(21.57±3.56%);晚凋比例分别为(2.52±0.45%)、(10.43±0.98%)、(7.07±0.78%);DHA 组早凋比例分别为(3.32±0.53%)、(4.1±0.26%)、(4.86±0.35%);晚凋比例分别为(3.69±0.79%)、(3.59±0.69%)、(3.91±0.49%);EPA 组早凋比例分别为(7.22±0.68%)、(9.55±0.68%)、(19.27±2.36%);晚凋比例分别为(11.89±2.45%)、(26.64±3.25%)、(10.98±2.16%),实验组细胞凋亡比例高于对照组,差异有统计学意义(p<0.05)。(4).在划痕实验检测结直肠癌细胞侵袭能力实验中,经AA、DHA、EPA干预后的HT29、RKO细胞伤口愈合率明显低于不经干预的对照组,(p<0.05)。(5).在qRT-PCR验证差异基因表达时,HT29细胞中,经AA、DHA、EPA分别作用48h后,TOLLIP基因的相对表达量分别升高了 8.33倍,降低了 0.87倍,升高了 2.09倍,差异有统计学意义(p<0.01),其余基因结果见表4-1;RKO细胞中,经AA、DHA、EPA分别作用48h后,ACVR1B基因的相对表达量分别升高了 2.37倍,降低了 0.60倍,升高了 1.28倍,差异有统计学意义(p<0.01),其余基因结果见表4-2;[结 论]1.经不同浓度PUFAs(AA、DHA、EPA)干预HT29、RKO细胞后,细胞存活率随浓度增加而减少,PUFAs具有抑制HT29、Rk0细胞增殖的作用,且PUFAs具有增强抗肿瘤药物OXA化疗敏感性的作用。2.经低、中、高浓度PUFAs(AA、DHA、EPA)干预后的HT29、Rk0细胞,经48h培养后,细胞凋亡率随PUFAs浓度增高而逐渐增加,PUFAs具有促进HT29、RKO细胞凋亡的作用。3.经低、中、高浓度的PUFAs干预后的结直肠癌细胞,可以阻止RKO细胞分裂周期停滞在G1期,对HT29细胞周期无明显影响。4.PUFAs可以延缓结直肠癌细胞HT29、RKO划痕实验的伤口愈合速率,抑制其侵袭能力。5.HT29、RKO细胞经多不饱和脂肪酸AA、DHA、EPA作用后,可以升高或降低所筛选出的差异基因的相对表达量,其中HT29细胞中AA对TOLLIP相对表达量影响升高最明显,为正常组的8.33倍,EPA对SEMA6A相对表达量影响降低最明显,为正常组的0.46倍。其中RKO细胞中AA对ACVR1B相对表达量影响升高最明显,为正常组的2.37倍,EPA对MAPK1相对表达量影响降低最明显,为正常组的0.27倍。
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