子宫内膜在卵巢排卵后及妊娠期间为准备及维持妊娠而发生的一系列重塑反应称为蜕膜化(Decidualization)，狭义的蜕膜化定义是内膜间质细胞在雌、孕激素作用下发生的形态学、生物化学方面的变化。蜕膜化过程伴随着内膜腔上皮细胞、间质细胞、淋巴细胞、细胞外基质和血管结构的一系列适应性改变。蜕膜功能的正常表达在胚胎着床、妊娠的建立与维持，以及分娩发动均起着重要的作用，研究其生长、退化和调控，对于明确胚胎着床机制和生育调节具有重要的意义。　　复发性流产是产科领域常见问题，一直困扰着广大医生和患者，其病因复杂。近几年来有学者认为，复发性流产患者子宫内膜间质细胞蜕膜化能力降低，导致胚胎着床“窗口期”延长、损伤胚胎或者对异常胚胎识别能力减低而发病，但是蜕膜化降低的原因和机制目前尚不清楚。　　Lefty基因是转化生长因子β超家族成员中为数不多的抑制剂之一，属于细胞信号分子，Lefty基因及其下游smad通路参与胚胎干细胞分化、胚胎发育等早发事件。Lefty基因在人类分泌晚期及月经期的子宫内膜中特异性表达，可以诱导增生期子宫内膜细胞分泌表达基质金属蛋白酶3、7、9，参与周期性的内膜基质分解及脱落调节过程。但在胚胎着床期的子宫内膜，Lefty基因却无表达;同样的研究发现在子宫内膜异位症或子宫腺肌症所致不孕患者的内膜中，Lefty蛋白的不成熟形式，即分子量为44kDa多肽大量表达。在小鼠的整个月经周期及妊娠1-3天内，Leftym RNA及蛋白均有表达，妊娠第9天消失;但Lefty基因转染内膜后，小鼠胚胎着床率明显减少。Lefty在子宫内膜中这种特殊的表达方式，提示其与子宫内膜蜕膜化有关。但是在人类子宫蜕膜中，随着妊娠的建立及维持，Lefty是否表达及变化趋势，目前尚未见报道。因此，我们拟通过PCR、Western blotting等生物化学方法，检测Lefty在早期复发性流产子宫蜕膜组织中的表达，证明Lefty在复发性流产蜕膜组织中表达增加，参与了复发性流产蜕膜化受损过程。　　子宫蜕膜化反应最明显的特征是内膜间质细胞增殖、分化成多倍体蜕膜细胞，细胞形态表现为大的单核或双核细胞，DNA增加4倍、8倍、或者更多倍，表明细胞经过了核内复制而不是细胞分裂。核内复制的特点提示我们在间质细胞蜕膜化过程中，细胞周期的改变导致DNA复制而无细胞分裂。在生殖周期中，子宫受到雌孕激素的调节，其中细胞周期调节因子也因发生周期性改变而发挥作用。在增殖期子宫内膜上皮细胞及间质细胞，特殊的周期素及周期素依赖链激酶表达增加，而在分泌期，P57等细胞周期调节因子在孕激素作用下表达增加。关于Lefty在蜕膜化过程中与细胞周期关系的研究极少。因此，我们拟通过基因重组、RNA干扰等分子生物学方法，检测体外间质细胞蜕膜化诱导过程中细胞周期因子cyclinD1及P57的表达，证明Lefty基因通过调控细胞周期来抑制间质细胞蜕膜化。　　方法：　　一、Lefty在早期复发性流产、正常早期妊娠子宫蜕膜中的表达　　1、PCR方法检测早期复发性流产、正常早期妊娠的子宫蜕膜中Lefty mRNA的表达水平。　　2、免疫组织化学法、Western Blotting法检测早期复发性流产、正常早期妊娠的子宫蜕膜中Lefty蛋白表达。　　二、Lefty基因在子宫内膜间质细胞(hESC)蜕膜化过程中的表达及作用　　1、原代培养人子宫内膜间质细胞(hESC)并进行传代。　　2、免疫细胞化学染色鉴定hESC细胞。　　3、hESC体外蜕膜化诱导及蜕膜化标志物PRL、IGFBP-1检测。　　4、构建pc-DNA3.1(+)Lefty过表达载体，酶切鉴定及测序，瞬时转染诱导48h的hESC。　　5、靶向hESC中Lefty基因的SiRNA干扰及筛选，瞬时转染诱导48h的hESC。　　6、荧光定量PCR、Western Blotting检测Lefty mRNA及蛋白表达，验证pcDNA3.1(+)-Lefty、SiRNA转染效率。　　7、Western Blotting检测各组hESCs中P57、cyclinD1表达水平。　　8、酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组hESCs上清液中PRL、IGFBP-1的含量。　　9、流式细胞仪检测Lefty基因对细胞周期的影响。　　结果：　　一、Lefty在早期复发性流产及正常早期妊娠子宫蜕膜中的表达　　1、PCR结果表明:妊娠早期子宫蜕膜Lefty mRNA相对表达水平为0.64±0.07，明显低于复发性流产组子宫蜕膜1.04±0.12(P＜0.05)。　　2、免疫组织化学结果表明:Lefty在子宫蜕膜组织的间质细胞浆内表达，在妊娠早期子宫蜕膜阳性表达率为20.0％，明显低于复发性流产组85％(P＜0.05)。　　3、Western blotting结果表明:在早期复发性流产及正常早期妊娠子宫蜕膜内，Lefty蛋白均以裂解后的分子量为34kDa活性蛋白形式出现。　　二、Lefty基因在人子宫内膜间质细胞(hESC)蜕膜化中的作用　　1、体外成功分离和培养人子宫内膜间质细胞(hESC)。　　2、免疫细胞化学染色鉴定结果表明细胞波形蛋白染色阳性，CD10染色阳性，角蛋白、Ⅷ因子及白细胞共同抗原染色均阴性，证实为人子宫内膜间质细胞。　　3、在MPA和8-Br-cAMP诱导下，hESC逐渐增大、变圆，胞浆透亮，细胞核增大。ELISA结果表明，培养上清液中的PRL和IGFBP-1在诱导第4天明显增加，证实体外间质细胞蜕膜化诱导成功。　　4、构建pcDNA3.1(+)-Lefty过表达载体，序列鉴定证实。筛选SiRNA片段，其中Lefty-homo-872使用量50nM沉默效率最高，为86.63％。　　5、荧光定量PCR及Western blotting结果表明:hESC转染Lefty过表达载体后，Lefty mRNA及蛋白明显增加;hESC转染SiRNA后，Lefty mRNA及蛋白明显降低。hESC蜕膜化诱导后，Lefty未成熟蛋白减少，成熟蛋白增加。　　6、ELISA结果表明:hESCs转染Lefty过表达载体后诱导，PRL、IGFBP-1分泌量明显降低;hESCs转染Lefty siRNA后诱导，PRL、IGFBP-1分泌量明显增加。　　7、流式细胞仪检测结果表明:hESCs蜕膜化诱导后，S期细胞比例明显减少，G0/1期细胞比例明显增加，发生G0/1至S期阻滞。hESCs转染Lefty过表达载体后，能够明显逆转已经发生的G0/1至S期阻滞。　　8、Western blotting结果表明:hESCs蜕膜化诱导后，P57蛋白增加，Cyclin D1蛋白下降;转染Lefty过表达载体后诱导，P57、Cyclin D1蛋白无明显变化，转染Lefty SiRNA后诱导，P57蛋白明显上调，CyclinD1蛋白明显下降。　　结论：　　1、Lefty基因及蛋白在早期复发性流产蜕膜组织内表达增加，可能通过抑制子宫内膜蜕膜化反应，参与早期复发性流产的发病过程。　　2、Lefty基因通过调控cyclinD1及P57的表达来调节、控制细胞周期、从而抑制子宫内膜间质细胞蜕膜化。