【摘 要】
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目的:扩增出慢性粒细胞白血病(CML)融合基因BCR/ABL中BCR外显子1(exon 1)上、下游的片段,将此二片段作为同源序列连入已有二loxp位点、新霉素抗性基因(neo)的质粒载体pF2 n
【出 处】
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中国协和医科大学 北京协和医学院 中国医学科学院 清华大学医学部
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目的:扩增出慢性粒细胞白血病(CML)融合基因BCR/ABL中BCR外显子1(exon 1)上、下游的片段,将此二片段作为同源序列连入已有二loxp位点、新霉素抗性基因(neo)的质粒载体pF2 neo ΔBK,构建出用于基因打靶的质粒载体pF2 El-4.同时,确定K562细胞是否表达胸苷激酶(tK)基因,以决定基因打靶后负筛选所用药物.并初步摸索转染的适当条件.结果:成功提取K562细胞基因组DNA,扩增出目的基因片段E1E2、E3E4,将其克隆于pGEM T-easy载体,构建了含目的基因片段的质粒pT E12和pTE34,并将此二片段亚克隆进由pF2 neo质粒改造的质粒pF2 neo ΔBK,基本完成了基因打靶载体pF2 E1-4的构建.证实K562细胞与已知表达tk基因的Hela细胞都对BUdR敏感,仅在敏感度上有些差异,推断K562细胞表达tk基因.确定将来转染后,应使用GANC做负筛选.转染HSV-tk在GANC条件下培养的死亡率与对照组相仿,预实验效果不理想.因表达绿色荧光蛋白的细胞数目也较少,判断原因为转染效率较低.将来要使用该研究构的载体pF2 E1-4,用基因打靶的方式,缺失掉BCR/ABL融合基因中BCR外显子1,观察打靶后BCR/ABL融合蛋白的酪氨酸激酶活性及K562细胞恶性程度发生何种变化,为进一步的CML基因的治疗研究打下理论和实践基础.
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