研究背景脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是一种非常严重的致残性中枢神经系统损伤,且尚无有效的治疗方法。脊髓损伤后常引起患者感觉和运动功能障碍以及大小便异常等,给社会、患者及其家属带来沉重的负担,是目前医学领域研究的热点之一。星形胶质细胞是中枢神经系统最丰富的胶质细胞,占90%以上,在营养、支持与神经元再生方面具有重要作用。脊髓损伤时,由于局部微环境发生改变,星形胶质细胞经过巨大的形态变化和大量的基因表达变异,活化成反应性星形胶质细胞。反应性星形胶质细胞增殖、迁移是胶质瘢痕形成的主要原因,胶质瘢痕形成已经成为中枢神经系统损伤后第二位病变。胶质疤痕可通过引起神经元的轴突或树突萎缩和生长锥的塌陷来抑制神经纤维重塑再生,影响脊髓损伤后的神经运动功能恢复。漆黄素系一种黄酮类化合物,日常蔬菜和水果中虽广泛分布但含量较少,具有神经营养、抗炎、抗氧化、抑制增殖等作用,被广泛用于肿瘤、神经等领域的研究。有研究表明,漆黄素可以抑制小胶质细胞的活化。另一项研究表明,在氯化铝诱导的小鼠脑损伤模型中,漆黄素可以促进小鼠的行为学恢复,减轻反应性形胶质细胞活化和炎症反应。但是目前,漆黄素对星形胶质细胞增殖、迁移的影响以及对脊髓损伤的神经保护作用及其具体机制研究较少,尚不明确。本研究分为以下两个部分:第一部分漆黄素抑制星形胶质细胞迁移和增殖的体外实验研究一、研究目的建立体外胶质瘢痕形成的模型,探索漆黄素对星形胶质细胞划痕愈合、迁移、增殖的影响及其作用机制,同时为我们后续研究漆黄素和胶质瘢痕形成在脊髓损伤中的作用奠定基础,为治疗脊髓损伤寻找一种新的潜在药物。二、实验方法1.星形胶质细胞的原代培养及鉴定取新生24 h的Sprague-Dawley(SD)乳鼠脑组织原代培养星形胶质细胞,于37℃,5%CO2培养箱培养4周成熟后,用胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)免疫荧光染色进行纯度鉴定,GFAP PB性细胞达95%以上,符合实验要求。2.星形胶质细胞划痕模型的建立划痕模型操作方法:于35 mm培养皿的盖子上划出纵横交错的5道格,将培养成熟的大鼠星形胶质细胞培养皿置于其上,用200 μL无菌枪头沿横、纵线将培养皿内的星形胶质细胞划伤换液除去脱落细胞,加入含10%FBS的DMEM培基。实验分组:对照组(划痕处理后仅加DMSO),实验组(划痕处理后加入终浓度分别为25 μM,50 μM漆黄素,漆黄素溶解于DMSO中)。分别在处理后Oh、24 h在倒置显微镜下拍照,观察划痕愈合情况,重复3次。3.流式细胞术检测漆黄素对星形胶质细胞凋亡的影响将不同浓度的漆黄素(12.5-50 μM)处理24 h后的星形胶质细胞,用不含EDTA的胰酶消化,2000 rpm离心后收集细胞;用PBS洗涤细胞两次,离心;加入 500 μL 的 Binding buffer 悬浮细胞;加入 5 μL Annexin V-KeyFluor 488 和 5μL的propidium iodide(PI)混匀;室温、避光、反应5～15min;lh内用流式细胞仪检测。重复3次。4.流式细胞术检测漆黄素对星形胶质细胞细胞增殖的影响培养成熟的星形胶质细胞加入含不同浓度的漆黄素(12.5-50 μM)和10μM EdU的全培处理24 h,胰酶消化,离心收集细胞,4%多聚甲醛(paraformaldehyde,PFA)室温孵育 30 min,离心后弃固定液,用含 0.5%Triton-X 100的PBS重悬细胞,通透5～15 min,离心弃上清。然后再加入1 ×Apollo(?)染色反应液,避光、室温孵育30 min后,离心弃上清,加入含0.5%TritonX-100的PBS,轻轻混匀,离心弃上清,加入PBS重悬细胞,进行流式细胞仪分析。重复3次。5.流式细胞术检测漆黄素对星形胶质细胞周期的影响将漆黄素(12.5-50 μM)处理24h后的星形胶质细胞用0.25%胰酶37℃消化2 min,1500 rpm离心收集细胞,用PBS洗涤细胞一次,加入70%冷乙醇500μL固定(2 h至过夜),4℃保存,染色前用PBS洗去固定液;加100μL RNaseA 37℃水浴30 min;再加入400 μL PI染色混匀,4℃避光30 min;1 h内上流式细胞仪进行分析。重复3次。6.Western Blot通过Western Blot检测不同浓度漆黄素处理星形胶质细胞后p-paxillin/paxillin、p-FAK/FAK、cyclinD1、p-Akt/Akt、p-Erk/Erk、p-p38/p38 蛋白表达的变化。然后应用Quantity One软件对Western Blot结果条带进行灰度值测定,对蛋白的表达情况进行相对定量分析。三、实验结果1.漆黄素对星形胶质细胞的凋亡无明显影响用不同浓度的漆黄素(12.5-50 μM)处理星形胶质细胞24 h后,用流式细胞术检测其对细胞凋亡的影响,结果显示,漆黄素处理组的细胞凋亡比例与对照组相比,无明显统计学差异。2.漆黄素可以抑制星形胶质细胞的迁移既往研究报道,采用体外划痕模型可以分析星形胶质细胞的迁移能力。本研究发现,漆黄素可以明显抑制星形胶质细胞往划痕中间空白区域迁移的能力,实验组划痕边缘细胞的迁移率明显低于对照组,漆黄素可以抑制划痕的愈合。同时,采用Western Blot技术检测不同浓度漆黄素处理星形胶质细胞后paxillin、FAK蛋白磷酸化水平的变化,发现漆黄素能明显抑制磷酸化的paxillin、FAK水平的活化。结果显示,漆黄素可以抑制星形胶质细胞的迁移。3.漆黄素可以抑制星形胶质细胞的增殖采用Click-iT EdU流式细胞术检测细胞增殖的情况,结果发现,不同浓度漆黄素(12.5-50 μM)处理星形胶质细胞的增殖比例明显低于对照组。采用流式细胞术检测细胞周期的情况发现,漆黄素组星形胶质细胞的G0/G1期百分比随着药物浓度增大逐渐升高,而S期和G2/M期星形胶质细胞比例相应降低,与对照组相比,具有明显的统计学差异。同时采用Western Blot检测细胞周期相关蛋白cyclinDl的变化,结果显示漆黄素明显抑制cyclinD1的表达,且呈浓度依赖性。以上结果表明,漆黄素可以抑制星形胶质细胞的增殖。4.漆黄素可以抑制Akt/Erk信号通路的活化采用 Western Blot 检测 p-Akt/Akt、p-Erk/Erk、p-p38/p38 表达的变化,发现漆黄素可以明显降低Akt、Erk的磷酸化水平,但是对p38的磷酸化水平无明显影响。四、结论本研究发现漆黄素可以抑制胶质划痕中星形胶质细胞的增殖和迁移,该作用可能是通过抑制Akt/Erk信号通路激活而实现的。第二部分漆黄素促进大鼠脊髓损伤神经保护作用和功能恢复的初步研究一、研究目的探索漆黄素对大鼠脊髓损伤后的神经保护作用和促进功能恢复的效果,为治疗脊髓损伤寻找一种新的潜在药物。二、实验方法1.脊髓损伤模型建立采用改良Allen’s打击法制作SD雄性大鼠(体重220～250 g)T10节段损伤模型,打击杆的总量为10 g,打击高度为25 mm。撞击成功标准为:撞击脊髓组织水肿、出血,硬脊膜完整呈紫红色,紧张,膨隆,大鼠尾巴出现痉挛性摆动,双下肢躯体回缩样扑动,呈迟缓性瘫痪。2.实验分组将126只实验大鼠随机分成3组:假手术组(n=42只),SCI组(n=42只),漆黄素组(n=42只)。漆黄素组在SCI后给予大鼠腹腔注射25 μmol/kg剂量漆黄素溶夜(溶剂为l%DMSO,0.9%生理盐水),每12 h间隔给药一次,连续给药7日。假手术组和SCI组注射1%DMSO溶液(溶剂为0.9%生理盐水),每12h间隔给药一次,连续7日。3.行为学评价分别在术后 1 d,3 d,7 d,14 d,21 d,28 d 采用 Basso,Beattie,and Bresnahan(BBB)评分观察脊髓损伤后大鼠的臀、膝、踝关节行走、躯干运动及协调情况。4.生化指标检测按照试剂盒操作说明书检测术后3 d,7 d脊髓组织中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力和丙二醛(malodialdehyde,MDA)含量,观察漆黄素抑制脊髓损伤后氧化应激的效果。5.液相芯片检测购买商业试剂盒,采用液相芯片方法检测术后1 d,3d,7 d血清中炎症因子IL-lβ.IL-4,IL-6,IL-10的变化,观察漆黄素对脊髓损伤后炎症反应的抑制作用。6.免疫组化分别在术后3 d、28 d用冷的生理盐水和4%多聚甲醛灌注取材。包含损伤区域的脊髓组织固定包埋好后,连续切片,厚度为5μm。分别用以下一抗进行孵育:IL-1β(1:200,兔源),IL-4(1:200,兔源),IL-6(1:200,兔源),IL-10(1:200,兔源),Ibal(1:100,鼠源),GFAP(1:100 鼠源),神经丝蛋白-200(NF-200)(1:200,鼠源),β-tubulin Ⅲ(1:800,鼠源),4℃过夜。然后用辣根过氧化物酶标记的鼠二抗或兔二抗室温孵育1h。DAB显色,DAPI染核。最后在正置显微镜(l0×,20×)下拍照。7.神经电生理检测脊髓损伤后28 d,应用神经电生理仪检测各组大鼠感觉诱发电位(sensory evoked potential,SEP)和运动诱发电位(motor evoked potential,MEP)的潜伏期和振幅,反映SCI后神经传导功能的变化。三、实验结果1.漆黄素能促进大鼠脊髓损伤后的行为学功能恢复采用BBB评分评价大鼠脊髓损伤后1 d,3 d,7 d,14 d,21 d,28 d的后肢运动恢复情况,发现损伤后(3 d-28 d)漆黄素组BBB评分明显高于SCI组,且漆黄素组能明显改善脊髓损伤后大鼠血尿、尿潴留等情况。2.漆黄素能抑制大鼠脊髓损伤后氧化应激反应通过检测脊髓损伤后3 d,7 d组织中SOD活力、MDA含量发现,漆黄素组SOD含量明显高于SCI组,说明漆黄素能够促进SOD活力的表达;与之相反,漆黄素组能够明显抑制脂质过氧化代谢产物MDA的表达,明显低于SCI组。3.漆黄素能抑制脊髓损伤后炎症反应通过液相芯片法检测损伤后1 d,3 d,7 d血清中IL-1β,IL-4,IL-6,IL-10的表达,发现漆黄素能够明显抑制促炎因子IL-1β,IL-4,IL-6的表达,而促进抗炎因子IL-10的表达。通过免疫组化法检测损伤后3 d组织中IL-1β,IL-4,IL-6,IL-10的表达情况,其结果与血清学结果一致。4.漆黄素能够抑制小胶质/巨噬细胞的活化同时采用免疫组化和Western Blot的方法检测术后3 d脊髓组织中小胶质/巨噬细胞的特异性标志物Ibal的表达情况,发现SCI组Ibal表达明显上调,漆黄素组能够抑制其表达,能够抑制小胶质/巨噬细胞的活化。5.漆黄素能够抑制胶质瘢痕的形成检测术后28 d组织中星形胶质细胞的特异性标志物GFAP,发现SCI组脊髓损伤周围区域GFAP表达明显上调,漆黄素可下调GFAP的表达,抑制星形胶质细胞增生,从而抑制胶质瘢痕的形成。6.漆黄素能够促进脊髓损伤后神经元轴突的再生与修复检测术后28 d组织中神经元及其轴突的特异性标志物NF-200,β-tubulin Ⅲ的表达情况,发现SCI组其表达明显降低,漆黄素组表达明显增高,漆黄素可促进神经元的再生与修复。7.漆黄素可改善脊髓损伤后的神经传导功能应用神经电生理仪检测大鼠的SEP和MEP,发现脊髓损伤后,SCI组SEP和MEP的振幅明显降低,潜伏期延长。漆黄素处理后,能缩短SEP和MEP的潜伏期,增强振幅,促进脊髓的上行感觉、下行运动传导通路的功能恢复。四、结论漆黄素可通过抑制脊髓损伤后氧化应激反应、炎症反应、小胶质/巨噬细胞活化以及胶质瘢痕的形成,发挥其促进脊髓损伤的神经保护和功能恢复作用。