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研究目的在骨肉瘤的临床治疗中,手术治疗和化疗是两种最主要的治疗手段,应用大剂量ADM的新辅助化疗,使骨肉瘤的临床预后有很大改观。但是药物耐药仍是临床骨肉瘤治疗上常见问题。P-gp介导的MDR是肿瘤耐药性的主要机制。已发现的多种逆转剂缺乏肿瘤细胞识别特异性,会导致化疗药物药动学发生改变,增加对正常组织的毒性。植物来源的药物资源丰富,作用靶点多,具有高效低毒的优点,显示其在逆转MDR方面有较好的应用前景。本研究应用大蒜素提取物DATS处理U2-OS细胞,观察其对阿霉素的耐药逆转作用,并就其逆转作用的分子机制进行深入探讨。研究内容和方法1.甲基四唑蓝(MTT)法增殖抑制实验1)测定DATS对U2-OS细胞的毒性作用,药物对细胞生长抑制率(%)=(1-实验孔A值/对照孔A值)×100%。选取DATS浓度为10umol/L、50umol/L、100umol/L,分别培养24、48、72小时后,上酶标仪测定A值。计算不同作用时间不同剂量的DATS对U2-OS细胞生长的抑制率。2)分组①单用ADM (lug/ml)②联合应用ADM (lug/ml)+DATS (10umol/L),分别培养24、48、72小时后,U2-OS细胞生存率的变化。2.光镜下细胞形态的改变取对数生长期的U2-OS细胞制成浓度为1×104/mL的细胞悬液,接种于预先铺置无菌盖玻片的24孔培养板内,分组为：①U2-OS,②U2-OS+DATS(50umol/L),③U2-OS+ADM(1ug/ml),④U2-OS+ADM(1ug/ml)+DATS(10umol/L).在37℃,5%CO2,及饱和湿度下培养48小时后,用HE法染色,光镜下观察,拍照。3.流式细胞术检测细胞膜P-gpU2-OS细胞在37℃,5%CO2,及饱和湿度培养箱中培养48小时。经1000rpm,5min离心后,分别以PBS洗涤2次,弃上清,PBS重新悬浮细胞,制成1×105/mL细胞悬液,取100μl细胞悬液加入藻红蛋白(PE)标记的鼠抗人P-gp单抗和同型对照,室温避光反应30min,即可上机检测。4.流式细胞术检测细胞凋亡实验分组：①U2-OS；②U2-OS+DATS(10umol/L)；③U2-OS+DATS(50umol/L)④U2-OS+DATS(100umol/L)；⑤U2-OS+ADM(1ug/ml)；⑥U2-OS+ADM(1ug/ml)+DATS(10umol/L)。在37℃、5%CO2、饱和湿度细胞培养箱中培养48小时。以1500rpm×10min离心后弃上清,4℃预冷PBS液(2-3m1)洗涤细胞两次。经消化、离心、重悬并计数,取1×105个细胞,依次加入500ul binding Buffer5μ lFITC标记的Annexin V,室温避光孵育10分钟,再加入10ul碘化丙啶,冰浴避光15分钟,流式细胞仪检测,FACS软件分析数据。右下象限是Annexin V+PI-细胞为早期凋亡细胞。5.RT-PCR检测基因的改变实验分组：①U2-OS；②U2-OS+DATS(50umol/L)反应条件：95℃5分钟,冰浴冷却,然后快速离心。加入1μl(1U/μl) Taq DNA聚合酶,快速离心混匀,加入30μl液体石蜡。循环条件：94℃预变性5min,94℃lmin,58℃～60℃lmin,72℃lmin,共26个循环。终产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。6. Western blot检测蛋白在细胞膜上的表达实验分组：①U2.OS；②U2-OS+DATS(50umol/L)提取细胞总蛋白,经SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳,转膜,封闭,以兔抗人Nf-kb(P65)抗体、鼠抗人IκB α抗体作为一抗,二抗为HRP(辣根过氧化物酶)标记的羊抗兔IgG,以密度值反应P-gp表达量。7.统计学处理实验数据以均数±标准差表示,采用SPSS17.0软件进行统计学分析处理。实验组与对照组之间采用t检验,多组间的比较采用单向方差分析的方法。P<0.05则认为差异有统计学意义。结果1.MTT检测结果DATS浓度为10umol/L.50umol/L.100umol/L,分别培养24、48、72小时后显示,DATS对U2-OS的生长抑制作用具有时间依赖性和剂量依赖性。应用小剂量DATS (10umol/L)联合ADM共同处理后,U2-OS细胞生存率明显低于单用ADM组(P<0.05)。2.光镜下细胞形态的改变对照组细胞贴壁良好,细胞生长旺盛,细胞轮廓清楚,形态规则；高倍镜下观察,胞膜完整,胞核深染且清晰,胞浆少,核仁增大,呈现恶性肿瘤细胞的典型形态特征。核分裂像多见。DATS处理48小时后,细胞数目明显减少,细胞收缩变圆或呈不规则形；高倍镜下观察,凋亡细胞呈圆形,胞体缩小,核染色质浓集,核固缩深染,胞质丰富且出现空泡,核浆比例降低,细胞出现凋亡形态改变。单独应用ADM作用48小时后,细胞增殖轻度受抑制,凋亡细胞比例低。小剂量DATS与ADM联合诱导细胞凋亡的作用较单独用药组明显增强,细胞形态不规则,高倍镜下观察,凋亡细胞比例增多,有的胞膜内出现凋亡小体,甚至有的细胞轮廓消失出现核崩解或坏死3.流式细胞术检测细胞膜P-gp：不同浓度DATS作用后,U2-OS细胞的P-gp表达率明显降低(P<0.05)。但各加药组间无显著性差异。4.流式细胞术检测细胞凋亡U2-OS细胞的自然凋亡率是0.47±0.03%,加入10umol/L、50umol/L、100umol/L浓度的DATS后,凋亡率分别为4.26±0.87,9.06±1.45,12.90±2.06%；单用ADM组凋亡率为3.39±0.09,联合应用小剂量DATS(10umol/L)后凋亡率为10.14±3.43%,两者相比较有显著差异(P<0.05)。5. RT-PCR检测基因的改变DATS可以明显降低U2-OS细胞的NF-κB/p65基因表达,并增加IκB α基因表达(P<0.05)。6. Western blot检测K562/A02细胞膜上蛋白表达的变化：DATS可以明显降低U2-OS细胞的NF-κB/p65蛋白表达,并增加IκB α蛋白表达(P<0.05)。结论1.DATS可以抑制骨肉瘤U2-OS细胞的增殖,增加骨肉瘤细胞对ADM的敏感性。2.DATS的这种作用是通过减弱P-gp的表达以减少化疗药物外排,和诱导U2-OS细胞凋亡增加来实现的。3.NF-κB通路参与了上述调节过程。