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凡纳滨对虾中的原肌球蛋白(tropomyosin,TM)是引发食用者对该类虾产生严重过敏的最重要因素之一,其引发的过敏反应不仅会降低过敏者的生活质量、危及生命,也会大大限制人们对于该类虾的消费。探讨超高压处理对于该蛋白免疫原性和结构的影响,对分析解释引发该蛋白免疫原性变化的内在原因具有重要的理论意义和实际应用价值。 本研究从天然的凡纳滨对虾TM(纯度>95%)出发,利用超高压处理(处理条件:压力分别为100、200、300、400、500、600、700以及800MPa;时间分别为10、20、30以及40min;温度分别为10、20、30和37℃)该蛋白,采用间接酶联免疫吸附法(indirect enzyme-linked immunosorbent assay,indirect ELISA)检测TM的免疫原性;生物膜层干涉技术(Bio-layer Interferometry,BLI)检测TM与其抗体的结合性能;圆二色谱法、红外光谱法以及苯胺基萘磺酸(ANS)荧光探针法检测分析超高压处理引发TM免疫原性变化可能的内在原因,包括:蛋白质二级结构组成的变化、蛋白表面疏水性。 超高压处理能够改变TM的免疫原性,不同条件下超高压处理对于TM免疫原性具有不同程度影响,在有些条件下处理后的TM的免疫原性会升高,其中10℃下400MPa超高压处理TM10min后免疫原性升高程度最大,与对照组比较其免疫原性约升高了27.6%。而在有些条件下会降低TM免疫原性,其中10℃下400MPa超高压处理TM40min后免疫原性降低程度最大,与对照组比较其免疫原性约降低了52.0%。但超高压处理后TM免疫原性在有些条件下会随压力的变化具有一定的趋势,其中20℃、30℃和37℃超高压处理条件下在一定压力范围内随着压力的增大其免疫原性呈先降低后升高的趋势。同时采用生物膜层干涉技术测定20℃条件下超高压处理对抗原抗体结合能力的影响结果表明,经超高压处理后TM与其抗体结合能力的变化结果与间接ELISA测定其免疫原性变化结果一致,进一步验证了结果的准确性。 圆二色谱法(CD)和红外光谱法(IR)分析结果表明超高压处理引起二级结构组成变化不大(CD分析结果:α-螺旋占804%~82.1%,β-折叠占0.0%~06%,β-转角占40%~4.9%,无规则卷曲占14.6%~15.2%; IR分析结果:α-螺旋占23.0%~24.7%,β-折叠占22.2%~253%,β-转角占41.2%~43.9%,无规则卷曲占9.1%~107%),因此超高压对TM二级结构含量的影响不显著。而ANS荧光探针法分析结果表明超高压处理能够改变TM的表面疏水性,影响其三级结构。不同超高压处理对TM表面疏水性的作用程度不同,某些条件下处理后的TM表面疏水性变化没有规律性,但在一定的压力范围内,随着压力的增大TM表面疏水性呈先升高后降低的趋势,其中超高压处理20℃下,在100~700MPa压力条件下处理40min时,随着压力的增大蛋白质表面疏水性呈降低趋势,在300MPa压力作用下最低,当压力继续增大至一定程度时(压力≤700MPa),其表面疏水性呈升高的趋势,但在800MPa时降低。 综上,超高压处理能够影响TM的免疫原性,能够引起TM三级结构的改变,但对TM二级结构组成影响不显著,并且超高压作用下引起免疫原性的变化与二级结构无相关关系,而与三级结构的改变存在显著正相关关系。