论文部分内容阅读
细胞自噬（简称自噬）是真核生物中保守的物质降解途径,它通过降解细胞内有害或多余的组分进行循环利用并帮助细胞度过逆境。自噬受阻会导致细胞不能完成自身物质的循环利用,破坏细胞内的物质平衡,在人体中可导致各种疾病的产生,如癌症、糖尿病以及神经退行性疾病。酿酒酵母是研究自噬的模式生物,了解并阐释其自噬的调控机制,可为人体自噬机制研究提供模式,为自噬相关疾病的预防和治疗提供理论基础。在自噬过程中,自噬被诱导后,自噬前体成核和延伸并包裹货物,然后形成闭合的双层膜自噬体并成熟,最终与液泡融合进行降解。根据被降解货物性质的不同,自噬分为非选择性自噬和选择性自噬。线粒体自噬和内质网自噬是两类常见的选择性自噬。自噬的正常发生主要依赖自噬相关蛋白（Autophagy-related gene,Atg）的调控,但后来发现多种其他蛋白,如参与囊泡运输的Rab/Ypt蛋白和转运必需内含体分选复合体（endosomal sorting complex required for transport,ESCRT）也调控自噬过程。例如,Rab1/Ypt1参与自噬的起始阶段,Rab7/Ypt7参与自噬体与液泡的融合,而Rab5/Vps21或ESCRT复合体缺失均可导致自噬前体不能正常闭合。本论文主要探讨ESCRT复合体在体外对自噬前体封口以及在线粒体自噬和内质网自噬中的作用,主要实验结果如下:1.ESCRT复合体直接参与自噬前体封口根据本实验室前期结果,我们推测ESCRT复合体亚基参与自噬前体的封口,进而开展了体外催化自噬前体封口的研究。首先,在大肠杆菌中表达ESCRT复合体关键亚基Snf7,Vps4和不具有ATPase活性的Vps4K179A蛋白并纯化。然后,通过梯度离心法富集经缺氮处理过的酵母菌株snf7Δ和vps4Δ中的自噬前体,分别对应加入纯化的Snf7和Vps4或Vps4K179A蛋白进行孵育开展体外实验,并用蛋白酶实验结合免疫印迹检测孵育后的样品。结果显示,snf7Δ和vps4Δ菌株的自噬前体中的货物蛋白完全降解,分别对应加入Snf7和Vps4蛋白可以使20%的货物蛋白免受蛋白酶K的降解,但加Vps4K179A不行,表明前两者使部分自噬前体封口,说明ESCRT复合体确实可以在体外直接催化自噬前体封口。2.ESCRT复合体参与线粒体自噬和其中线粒体自噬体的封口通过检测线粒体自噬标记蛋白Om45的定位和降解情况,发现ESCRT复合体参与氮饥饿诱导的线粒体自噬,而不影响乳酸培养基中生长至对数后期诱导的线粒体自噬。另外,vps21Δ中氮饥饿诱导的线粒体自噬不受影响,表明ESCRT复合体只参与特定条件下的线粒体自噬且不受Vps21的调控。Atg32是线粒体自噬受体蛋白,它识别并结合受损的线粒体,再通过Atg32与选择性自噬支架蛋白Atg11互作,将受损的线粒体招募到自噬体组装位点,继续通过线粒体自噬前体的延伸、闭合、融合,最终进入液泡降解并循环利用。为了了解ESCRT复合体参与线粒体自噬的哪个阶段,首先观察了 Atg32的亚细胞定位。在snf7Δ和vps4Δ中,Atg32在液泡膜旁呈多点状堆积,表明Atg32的正常运输受阻。为了进一步确定液泡膜旁堆积的多点状Atg32是否代表着线粒体自噬体,观察了 Atg32和自噬（前）体标记蛋白Atg8的共定位情况,结果显示有Atg8点的地方大都有Atg32点与其共定位,结合Atg32缺失时线粒体自噬不能发生的事实,初步判断Atg32可能堆积在线粒体自噬（前）体上。以上结果表明,ESCRT突变体snf7Δ和vps4Δ中,线粒体自噬过程受阻,线粒体不能正常进入液泡进行降解。进一步采用蛋白酶保护实验检测了snf7Δ和vps4Δ中堆积的线粒体自噬体的封口情况。从氮饥饿处理后的突变体细胞中纯化出含有线粒体和线粒体自噬体的膜状结构,利用蛋白酶保护实验结合免疫印迹法检测GFP标记的线粒体外膜蛋白Om45的降解情况。在atg32Δ中,线粒体自噬体没有形成,Om45暴露在外面被蛋白酶K完全降解。相反,在ypt7Δ中,线粒体自噬体完全闭合,约20-30%的Om45受到自噬体膜的保护而免受降解。而snf7Δ和vps4Δ中Om45完全降解,表明线粒体自噬体没有封口,为线粒体自噬前体,ESCRT复合体参与了线粒体自噬前体的封口。3.Snf7通过与Atg11互作被招募至线粒体自噬前体上在线粒体自噬中,Atg11-Atg32的互作位点代表着线粒体自噬前体。如果ESCRT复合体参与线粒体自噬前体封口,ESCRT关键亚基Snf7应该会定位到线粒体自噬前体上。荧光显微镜观察的结果显示,Snf7与Atg11-Atg32的互作位点存在共定位,表明Snf7确实定位到线粒体自噬前体上。在非选择性自噬中,ESCRT复合体通过Atg17和Snf7之间的相互作用,被招募到自噬前体进行封口。为了了解ESCRT复合体调控线粒体自噬前体封口的分子机制,本研究检测了 Snf7和Atg蛋白之间的互作,发现除了与非选择性自噬支架蛋白Atg17互作外,Snf7还与选择性自噬支架蛋白Atg11互作。为了进一步检测ESCRT复合体是否通过Atg11和Snf7的互作将其定位到线粒体自噬前体上参与封口,追踪了 Atg11和Snf7的互作位点,结果显示Atg11与Snf7的互作发生在线粒体上。以上结果表明,当线粒体自噬发生时,Atg11与Snf7相互作用,将其招募到Atg11-Atg32标记的线粒体自噬前体,同时Atg32结合有待降解的线粒体,极有可能利用ESCRT的封口功能完成对线粒体自噬前体封口。在非选择性自噬中,Vps21通过调控ESCRT并影响Snf7与Atg17的互作来参与自噬前体封口。在线粒体自噬中,Vps21缺失不影响Snf7与Atg11的互作。这些结果表明ESCRT可能通过不依赖Vps21的Snf7-Atg11互作来参与线粒体自噬。4.ESCRT复合体参与内质网自噬内质网自噬可以消除内质网上错误折叠或多余的蛋白质来保障细胞器的稳态。酵母中存在两种不同的内质网,即外周内质网和核周内质网。通过检测内质网自噬通用标记物Sec63的亚细胞定位以及降解情况,发现ESCRT复合体参与氮饥饿诱导下的内质网自噬。为了探讨ESCRT复合体在外周内质网和核周内质网自噬中的作用,进一步检测了外周内质网蛋白Rtn1和核周内质网蛋白Hmg1的亚细胞定位和降解情况。结果表明,ESCTRT复合体既参与外周内质网自噬,也参与核周内质网自噬。由于酵母细胞中核周内质网与细胞核外膜是完全重叠的,通过检测细胞核蛋白Htb1的亚细胞定位和降解情况,发现ESCRT复合体也参与细胞核自噬。内质网自噬中存在两个受体蛋白Atg39和Atg40,其中Atg39负责识别核周内质网,Atg40主要负责识别外周内质网。荧光观察的结果显示,snf7Δ和vps4Δ中Atg39和Atg40都堆积在自噬（前）体上,表明内质网自噬受体蛋白的循环受到了影响。过量表达Atg40可以促进snf7Δ和vps4Δ中内质网自噬水平,表明ESCRT亚基缺失导致的内质网自噬缺陷可以通过过量表达内质网自噬受体蛋白绕过去。以上内容探讨了 ESCRT复合体在细胞自噬中的一些作用,发现ESCRT复合体不仅可以直接催化非选择性自噬中自噬前体封口,而且还参与两类选择性自噬。在线粒体自噬中,ESCRT复合体通过Snf7与Atg11的互作将ESCRT复合体招募至线粒体自噬前体进行封口。在内质网自噬中,ESCRT复合体缺失影响内质网自噬和其受体蛋白Atg39和Atg40的正常定位,但具体调控机制暂不清楚。本文的研究结果拓宽了 ESCRT复合体在自噬中的功能,为研究选择性自噬的调控因子与机制提供了新的实验数据,也为人体中研究相关机制及相关联疾病的发病机制提供基础。