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草莓是多年生草本植物,其果实色泽鲜艳,柔软多汁,营养丰富,素有“水果皇后”的美称。我国是草莓生产和消费大国,种植面积居世界第一。目前,我国草莓种植以设施栽培为主。畸形果是草莓设施栽培过程中一个很严重的问题。花托表面的雌蕊受精不均匀是导致草莓果实畸形的最重要因素;而花药中成熟花粉粒的活性是草莓雌蕊成功受精的关键。雌蕊受精之后,草莓果实的发育与成熟决定其大小、颜色和营养成分等果实品质。因此,研究草莓花药和果实发育及成熟的调控机制对提高草莓品质具有重要意义。森林草莓(Fragaria vesca)是二倍体,其在花和果实发育等方面的特性与栽培草莓(多为八倍体的凤梨草莓F.× ananassa)基本相同,且基因组简单、转化体系相对成熟,是研究栽培草莓的模式植物。本研究首先系统鉴定了森林草莓中对果实成熟具有重要调控作用的脱落酸(ABA)的关键合成基因(FveNCEDs),分析了各FveNCED基因在森林草莓主要组织器官中、果实不同成熟阶段及非生物胁迫处理下的表达模式,进而推断出各FveNCED基因的功能。此外,在对FveNCED基因的研究过程中,发现部分细胞分裂素(CKs)受体基因(HKs)的表达在森林草莓果实成熟后期快速增加。HK基因在CKs信号转导过程中起着非常重要的作用。因此,本研究还系统分析了森林草莓中FveHK基因的特征及其在森林草莓主要组织器官中的表达模式和对外源CKs的响应,并利用RNA沉默技术(RNAi)分别沉默不同FveHKs的表达,来探究不同FveHKs的功能。主要研究结果如下:1.森林草莓中共有3个FveNCED基因。在森林草莓幼苗中,不同分生组织中、花早期的发育中、花的心皮组织的发育过程中及授粉后的柱头和花柱中,FveNCED1的表达都占有明显的优势;在果实早期发育过程中,FveNCED2表达水平相对较高;在花药发育过程中,FveNCED1和FveNCED2的表达水平相似;FveNCED6只在早期的花中及花的部分组织中有一定的表达;在小孢子细胞中所有的FveNCED基因都有一定的表达,但在成熟花粉粒中它们都不表达。2.在森林草莓果实成熟过程中,FveNCED2是唯一持续上调的基因,且和果实内源ABA水平的上调模式一致。在森林草莓幼苗的不同非生物胁迫(PEG渗透、热和冷)处理过程中,FveNCED1是最主要的响应基因,其表达大幅上调;FveNCED2仅对冷胁迫有一定的响应,而FveNCED6在这些处理中都基本不表达。这表明FveNCED1和FveNCED2分别是森林草莓非生物胁迫响应过程中和果实成熟过程中的ABA合成关键基因。3.森林草莓中有 4 个 CKs 受体基因:FveHK2a,FveHK2b,FveHK3和和FveHK4。其中,FveHK2a和FveHK2b编码的蛋白序列极为相似(相似度为91.83%),但它们在森林草莓不同组织/发育阶段中的表达模式不同:FveHK2a在生殖器官中的表达一般高于FveHK2b,而FveHK2b在大部分营养组织中的表达高于FveHK2a。FveHK3在森林草莓大部分组织器官中都有较高的表达水平;FveHK4在大部分营养器官中也有较高的表达水平,在生殖器官中,其在花药、未授粉的柱头和花柱及胚中的表达水平明显高于其他组织。此外,FveHK4的表达在森林草莓果实成熟过程中快速增加,并在成熟果实中明显高于其他3个受体基因的表达。外源CKs的处理能快速诱导FveHK4的表达,而对其他3个受体的表达影响较小。4.本研究分别构建了森林草莓各CKs受体基因的RNAi载体:FveHK2-RNAi、FveHK3-RNAi 和 FveHK4-RNAi,其中 FveHK2-RNAi 同时沉默 FveHK2a 和 FveHK2b。对转基因植株的观察发现,在正常生长条件下,不同FveHKs沉默株系的营养生长与野生型没有明显差异;但在黑暗条件下,FveHK2-RNAi离体叶片的衰老较野生型(WT)提前,说明FveHK2很可能是传递CKs信号抑制叶片衰老过程中的关键受体。此外,FveHK4受体沉默后会导致森林草莓离体叶片的衰老明显延迟。这些结果揭示了各FveHK基因在森林草莓叶片衰老中的不同功能。5.FveHK2和FveHK3沉默后,森林草莓果实能正常发育,而FveHK4沉默后导致自花授粉的果实败育。使用WT花粉授粉,可使FveHK4-RNAi株系正常结实。显微镜观察、花粉染色和萌发等实验结果显示,FveHK4-RNAi株系成熟花药中有90%以上的花粉粒都表现出明显的萎缩畸形且不育。通过对花粉粒的扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)切片的观察发现,不育花粉粒一般从萌发孔处向内萎缩,其细胞内的细胞质缺乏,而且花粉外壁明显增厚,表明FveHK4对森林草莓花粉粒的发育有着很重要的作用,其沉默会导致森林草莓雄性不育。6.通过对不同发育阶段花粉粒细胞的观察,发现FveHK4-RNAi株系的花粉粒在花药发育S10阶段晚期(S10c)开始有相对明显的异常。对花药石蜡切片和TEM切片的观察表明,FveHK4-RNAi花药的绒毡层细胞在S10阶段的降解延迟。进一步对WT和FveHK4-RNAi株系S9和S10阶段花药分别进行RNA-seq测序和RT-qPCR分析,结果发现CKs信号基因FveRR5、森林草莓花药特异表达的碳水化合物运输和代谢相关基因 FveSTP1、FveBGAL7a、FveBGAL7b和FveBGLU17等在 FveHK4-RNAi 株系S9和S10阶段花药中的表达水平显著低于野生型;而花粉外壁合成相关基因FveMS2和FveCYP704B1、赤霉素降解基因FveGA2ox1在FveHK4-RNAi株系S10阶段花药中比野生型显著上调。这些结果表明,以上基因很可能在FvHK4沉默引起的森林草莓花粉败育中发挥作用。综上所述,本研究分别分析了森林草莓中的ABA关键合成基因FveNCEDs和CKs受体基因FveHKs的特征及其在森林草莓果实等不同组织/发育阶段中以及在不同处理条件下的表达模式;通过RNAi技术研究了各FveHK基因的功能,并重点分析了FveHK4基因的沉默对森林草莓花药发育的影响及造成雄性不育的可能机制。本研究为进一步探究ABA和CKs在草莓生长发育中的作用及解析CKs对植物花药发育的调控机制打下基础,同时也可能为草莓产量和品质的改良提供依据。