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目的:探讨与鞭毛内运输复合物B（IFT-B）相关的三种蛋白:COP9信号体复合物亚基5（COPS5）、自噬相关蛋白5（ATG5）和亮氨酸拉链转录因子样1（LZTFL1）在精子发生和雄性生殖中的作用及其作用机制。方法:使用酵母双杂交、细胞共定位分析、免疫共沉淀实验或萤光素酶蛋白互补实验,验证COPS5/IFT20或LZTFL1/IFT27两个蛋白之间的相互作用。通过Western blot检测COPS5、ATG5和LZTFL1蛋白在小鼠组织中的表达水平。使用免疫荧光染色确定这三种蛋白在小鼠生精细胞中的定位。将Cops5flox/flox或A tg5flox/flox小鼠,分别与Stra8-iCre转基因小鼠杂交,构建生精细胞特异性敲除Cops5基因（Cops5 cKO）或Atg5基因（Atg5cKO）的小鼠模型。通过Westernblot、RT-PCR、qPCR或免疫荧光染色检测Cops5 cKO、Atg5 cKO和全身性Lztfl1基因敲除（Lztfl1 KO）小鼠的基因敲除效率。通过生育能力测试、精子计数、精子活力分析和观察精子形态评估三种基因敲除小鼠的生育能力。对睾丸或附睾进行HE染色、透射电子显微镜（TEM）或扫描电子显微镜（SEM）检测,分析三种基因敲除小鼠的精子发生过程是否正常。通过RNA-seq、比较蛋白质组学、流式细胞术、TUNEL染色、线粒体染色、Westernblot、RT-PCR或qPCR,检测三种基因敲除后对相应下游基因的影响。结果:1)COPS5是IFT20的结合蛋白。COPS5在小鼠的睾丸中大量表达,在成熟精子中不表达。Cops5 cKO小鼠完全不育,其精子数量显著减少（9.83±2.75Con vs.0.39±0.23cKO,106/mL,P＜0.05）,生精细胞在减数分裂前期大量凋亡,睾丸中有助于维持细胞活力的多聚核糖聚合酶-1（PARP-1）和调节生精细胞凋亡的FANK1蛋白的表达显著减少,促进细胞凋亡的关键蛋白Caspase-3的表达显著增加。突变小鼠的顶体形成缺陷。在Cops5 cKO小鼠中,IFT20蛋白在睾丸中的表达水平显著降低,且在圆形精子细胞顶体上的定位发生了改变。但在生精细胞Ift20基因特异性敲除（Ift20 cKO）小鼠中,COPS5在睾丸中的表达水平和在生精细胞中的定位都没有改变。对第一波精子发生期间不同时间点的睾丸形态学分析表明,Cops5 cKO小鼠的精子发生从小鼠出生后第16天开始异常。流式细胞术分析显示,对照小鼠和Cops5 cKO小鼠出生后第16天睾丸的细胞群之间没有明显变化。分别使用对照和Cops5 cKO小鼠第16天的睪丸进行蛋白质组学研究表明,在Cops5 cKO小鼠中鉴定出2978种发生改变的蛋白质。其中,399种蛋白的表达显著降低,65种蛋白质的表达显著增加,这些显著变化的蛋白质主要在自噬、细胞凋亡、高尔基体运输、囊泡蛋白运输、纤毛生物发生、甲基化、磷酸化、泛素化、蛋白酶体降解、RNA运输或定位、mRNA剪接、细胞核和精子发生等生物过程中起作用。RNA-seq揭示了在Cops5 cKO小鼠中有9,912个转录物发生了改变。其中,441个转录物的表达显著降低,11个转录物显著增加。240个基因在蛋白质和mRNA水平上的表达均显著降低,这些基因许多是精子发生的关键调节因子,其中包括Ddx4,Tdrd1,Tdrd5,Mil1和Mybl1在内的piRNA途径中的关键成分。通过qPCR或Westernblot验证了部分下调的piRNA途径成分和精子相关蛋白的表达,它们均显示出不同水平的下降。2)Atg5 cKO小鼠睾丸中Atg5 mRNA和ATG5蛋白的显著降低,表明成功构建小鼠模型。在Atg5 cKO小鼠睾丸中,自噬标记物LC3-Ⅱ的表达水平显著降低,自噬受体SQSTM1/p62的表达水平显著升高,表明睾丸中自噬活性降低。突变小鼠的受精能力显著降低,约70%（12/17）的雄性小鼠不育。与对照小鼠相比,精子数量（13.85±1.70Con vs.4.0±2.83cKO,106/mL,P＜0.05）和活力（67.23±2.61Con vs.41.37±3.12cKO,μm/s,P＜0.05）也显著降低。对突变小鼠的睾丸进行组织学分析显示,在生精小管的管腔中存在大量的胞质残留体。附睾尾部管腔中充满了脱落的生精细胞、大胞质体和头部或鞭毛异常的精子。通过电子显微镜检测发现,突变小鼠的尾部附睾中的精子存在大量畸形的头部,精子鞭毛中段的附属结构不连续,精子的顶体结构形成异常以及精子个体化失败。附睾精子的免疫荧光染色显示,突变小鼠的线粒体和顶体分布异常。3)LZTFL1是IFT27的结合蛋白。Western blot表明LZTFL1蛋白在小鼠的睾丸中高度表达。在第一波精子生成过程中,LZTFL1蛋白在精子分化阶段大量表达。对生精细胞的免疫荧光染色结果显示,在圆形精子细胞中,LZTFL1分布在细胞质中;在长形精子细胞中,LZTFL1蛋白出现在靠近精子领的位置和发育中的鞭毛上。对全身性Lztfl1基因敲除（Lztfl1 KO）小鼠进行繁殖力评估发现,Lztfl1 KO小鼠的生育能力显著降低,其精子数量显著下降（7.48±1.33Con vs.3.15±2.41KO,106/mL,P＜0.05）,异常精子显著增加（2.78±2.21Con vs.34.9±3.2KO,%,P＜0.05）。体外生育能力评估显示,Lztfl1 KO小鼠的体外受精能力显著降低（78.83 Con±6.90 VS.36.72±24.81KO,%,P＜0.05）。IFT27蛋白在Lztfl1 KO小鼠的睾丸中表达显著降低,但是其他IFT蛋白（包括IFT20,IFT81,IFT88和IFT140）的睾丸表达水平没有明显变化。结论:本研究结果表明,IFT-B的三种相关蛋白COPS5、ATG5和LZTFL1都在精子发生过程中具有重要作用。首先,COPS5为IFT20的上游蛋白,可调节IFT20的表达和定位。COPS5可通过多种机制维持正常的精子发生,包括细胞凋亡、IFT和piRNA途径;其次,ATG5通过诱导自噬维持正常的发育过程,其参与精子发生的多个方面,对雄性生育至关重要;最后,LZTFL1在小鼠精子发生和雄性生育中有重要作用,LZTFL1为IFT27的下游蛋白,其在睾丸中的表达受到IFT27的影响。