论文部分内容阅读
AP2/ERF转录因子参与了植物生长发育和对外界胁迫响应等多种生物学过程，在基因转录调控中发挥重要作用。菊花脑(Chrysanthemum nankingense)是原产我国的菊属野生种之一，是栽培菊花育种的重要亲本，同时也是一种可食用的保健蔬菜，富含抗癌类黄酮和芳香油，具有很高的育种利用和经济价值，是开展优异基因挖掘的较理想材料。本研究对菊花脑CnAP2/ERF转录因子家族基因进行了克隆，并对其表达特性、亚细胞定位及转录激活活性等进行了研究，以期为CnAP2/ERF参与菊花脑胁迫应答及发育调控的研究奠定基础，同时为菊花种质创新提供优异基因资源。主要研究结果如下: 1.根据菊花脑EST数据库筛选出7个AP2/ERF基因同源片段，据此设计基因特异引物，以菊花脑为材料，通过3、5 RACE-PCR克隆获得了2个ERF亚家族基因，分别命名为CnERF1（序列号:KF986840）和CnHRE2（序列号:KJ817308），以及5个DREB亚家族基因，分别命名为CnDREB1-1，CnDREB1-2，CnDREB1-3，CnDREB3-1，CnDREB3-2，基因登录号分别为KF986841，KF986842，KF986843，KF986844，KF986845。7个AP2/ERF基因全长从683bp到1246bp不等，均含有一个64或65个氨基酸组成的AP2/ERF保守结构域。 2.荧光定量PCR结果表明，低温、机械损伤处理促进了CnERF1和CnDREB3-2的表达，机械损伤促进了CnDREB1-1的表达。高盐处理则抑制CnERF1，CnDREB3-2和CnHRE2的表达。CnDREB1-2和CnDREB1-3表达量在ABA、SA、高盐和JA处理后有不同程度的下调。低温处理后，CnHRE2的表达量迅速提高，但SA和JA处理下其表达量下降。 3.构建了绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein, GFP）融合表达载体pMDC43-GFP-CnERF1, pMDC43-GFP-CnDREB1-1, pMDC43-GFP-CnDREB1-2,pMDC43-GFP-CnD REB1-3,pMDC43-GFP-CnDREB3-1,pMDC43-GFP-CnDREB3-2,pMDC43-GFP-CnHRE2，农杆菌介导法转化洋葱表皮细胞。亚细胞定位分析显示:CnERF1, CnDREB1-1, CnDREB1-2, CnDREB1-3, CnDREB3-1, CnDREB3-2和CnHRE2蛋白均定位在细胞核上。 4.构建了7个基因的酵母效应质粒pGBKT7-CnERF1，pGBKT7-CnDREB1-1，pGBKT7-CnDREB1-2,pGBKT7-CnDREB1-3,pGBKT7-CnDREB3-1, pGBKT7-CnDREB3-2和pGBKT7-CnHRE2，转入酵母菌株Y2H中，分别在单缺陷培养基SD/-Trp上筛选后转入双缺培养基SD/-His-Ade上培养。结果表明，CnDREB1-1，CnDREB1-2，CnDREB1-3和CnHRE2表现出转录激活活性，而CnERF1，CnDREB3-1和CnDREB3-2则无明显的转录激活活性。 5.构建了植物表达载体pCAMBIA1301-CnHRE2，利用农杆菌介导的花序侵染法将CnHRE2转化拟南芥，通过潮霉素抗性筛选及PCR鉴定，获得了CnHRE2转基因拟南芥。