论文部分内容阅读
ADP-核糖(ADPR)是NAD+,环形ADP-核糖和聚ADP-核糖的酶催化代谢物。细胞内高水平的ADP-核糖使体内蛋白质产生非催化型的ADP-核糖化,从而导致蛋白质功能的失活,此外高水平的ADPR还会干扰正常ADPR依赖型酶的生理功能。ADP-核糖焦磷酸水解酶属于Nudix水解酶家族,这是一类催化与残基X相连的二磷酸核苷的水解酶类,Nudix家族蛋白质含有保守序列GX5EX7REUXEEXGU,这些保守氨基酸在Nudix水解酶中参与催化位点的形成。人源ADP核糖焦磷酸水解酶(hNUDT5)催化水解ADP-核糖,生成AMP和5-磷酸核糖。本研究从人CD34+造血干细胞中克隆出hNUDT5基因,通过晶体学和X衍射的方法得到该蛋白的四种三维结构:①apo全酶分子结构;②底物ADPR和蛋白二元复合物结构;③产物AMP、金属离子和蛋白三元复合物结构;④底物类似物AMPCPR、金属离子和蛋白三元复合物结构。对该蛋白各种三维结构之间差异的比较分析,揭示出该蛋白结合底物ADPR选择特异性的分子机制。研究表明,hNUDT5是以二聚体形式发挥功效,一个亚基的N端结构域和另一个亚基的C端结构域形成底物结合口袋,二聚体的两个结合口袋具有等效生物活性,底物ADPR通过与底物结合口袋周围侧链氨基酸的相互作用而被识别。hNUDT5一个亚基的TRP28和另一个亚基的TRP46能够识别底物ADPR分子的嘌呤环,它们三者之间可形成强的π-π堆积,这是该蛋白选择结合的底物大多数为ADP-糖类的关键。通过与大肠杆菌中Orf209和Orf186这两种ADP核糖焦磷酸水解酶结构的比较,揭示出该类蛋白L8 Loop上的芳香族氨基酸对底物APnA的识别至关重要。通过与另一人源ADP核糖焦磷酸水解酶(hNUDT9)结构的比较,阐明了hNUDT5对底物O-acetyl-ADPRs有水解活性,而hNUDT9对底物O-acetyl-ADPRs无水解活性的分子基础。在上述结构研究的基础上,将hNUDT5活性中心周围的重要氨基酸分为两类:一类氨基酸与底物ADPR的结合相关;另一类氨基酸与金属离子的结合及生化活性相关。通过测定hNUDT5突变体酶学常数Km值和kcat值的变化,阐明了这些氨基酸在催化过程中的作用。基于所测定的底物类似物、金属离子和蛋白三元复合物过渡态结构,提出了hNUDT5的催化反应机理模型,为同类酶进一步的功能研究提供了结构基础和理论依据。