论文部分内容阅读
鱼类富含有益于人体健康的n-3高不饱和脂肪酸（n-3 HUFA）,尤其是二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）,从而赋予其特别的营养价值。海水肉食性鱼类合成HUFA的能力大多很弱或缺乏,因此参与机体生理代谢或沉积在肌肉的HUFA主要从饲料中摄取。近年来,随着配合饲料中富含HUFA的鱼油、鱼粉添加量的降低,导致养殖鱼类的HUFA含量普遍下降,从而影响养殖产品的营养价值。因此,提高HUFA在鱼类肌肉中的沉积水平成为一个有意义的课题。然而,目前有关鱼类肌肉中HUFA沉积的特性及分子机制还知之甚少。为此,本研究选择HUFA合成能力很弱或缺乏的海水鱼卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）为对象,利用不同n-3 HUFA水平的饲料在海上网箱中喂养8周,从鱼的n-3 HUFA营养需求,肌肉的HUFA沉积特性,HUFA沉积相关基因的筛选、克隆、功能鉴定及表达调节等方面,较系统深入地研究其肌肉的HUFA沉积特性及调控机制。主要研究内容及结果结论如下:一.饲料n-3 HUFA水平对卵形鲳鲹幼鱼生长、生理生化指标及肌肉HUFA沉积特性的影响配制等氮（45%左右）、等脂（12%左右）但n-3 HUFA水平不同的6种饲料（D1-D6）,其中D1只添加鱼油,n-3 HUFA水平为2.30%（对照组）;D2-D6以植物油为脂肪源,利用EPA-和DHA-纯化油调配使饲料的n-3 HUFA水平分别为0.64%、1.00%、1.24%、1.73%和2.10%。利用此6种饲料在海上网箱中投喂卵形鲳鲹幼鱼（初始体重14.84±0.06 g）8周后,D1-D6组鱼的生长性能无显著差异（P＞0.05）,但D4和D5组的生长性能最优。D3和D4组鱼的血清中总超氧化物歧化酶（T-SOD）活性显著高于D2和D6组（P＜0.05）,肝脏的丙二醛（MDA）含量显著低于D1、D5和D6组（P＜0.05）。肌肉品质相关指标方面,D4和D5组肌肉的粗脂肪含量显著高于D2和D3组（P＜0.05）,持水力和胶粘性显著高于其他各组（P＜0.05）;D4组总抗氧化能力显著高于D1、D2和D6组（P＜0.05）;D3、D4和D6组MDA含量显著低于D1组（P＜0.05）。在D2-D6组,随着饲料n-3 HUFA水平的提高,血清、肝脏、肌肉和腹部脂肪的EPA、DHA和n-3多不饱和脂肪酸（PUFA）的水平增加（P＜0.05）,肝脏PUFA转运相关的脂肪酸转位酶36（cd36）表达水平显著提高（P＜0.05）。D3-D6组肝脏的脂质合成代谢相关基因,如固醇调节元件结合蛋白-1（srebp-1）和脂肪酸结合蛋白1（fabp1）的m RNA水平均显著低于D2组（P＜0.05）;D4组肌肉的脂质合成相关基因,如脂肪酸合成酶（fas）、cd36和过氧化物酶体增殖物激活受体γ（pparγ）的表达水平显著高于其他组（P＜0.05）。D4和D5组脂质分解和转运相关基因,如肉毒碱棕榈酰转移酶1（cpt1）和载脂蛋白b 100（aprob 100）的表达水平显著高于D2组（P＜0.05）。此外,D3-D6组肝脏脂肪含量和促炎症因子细胞介素8（il-8）的表达水平显著低于D2组（P＜0.05）,且和D1组无显著差异（P＞0.05）;D4和D5组抗炎症因子白细胞介素10（il-10）和转化生长因子β1（tgf-β1）的表达水平最高,且显著高于D1或D2组（P＜0.05）。在D2-D6组,随着饲料中n-3 HUFA水平的增加,肌肉的甘油三酯（TAG）、磷脂酰胆碱（PC）和磷脂酰乙醇胺（PE）的EPA、二十二碳五烯酸（DPA）、DHA和n-3 PUFA占比（占总脂肪酸%）均显著增加（P＜0.05）,TAG分子sn-1/3和sn-2位的n-3 HUFA也显著增加（P＜0.05）。磷脂（PE和PC）中EPA+DHA含量显著高于TAG,PE中的含量显著高于PC（P＜0.05）。肌肉中TAG分子sn-2位16:0、18:0、22:5n-3、22:6n-3、SFA和n-3 PUFA占比均显著高于sn-1/3位,而16:1、18:1n-9c、18:2n-6、18:3n-3、20:4n-6、20:5n-3、MUFA和n-6 PUFA占比显著低于sn-1/3位（P＜0.05）,且与饲料n-3 HUFA水平无关。以上结果表明,D4和D5饲料（1.24-1.73%n-3 HUFA）投喂组鱼的生长性能、抗氧化能力、脂肪酸组成、免疫力和肝脏脂质代谢功能等相关指标较优;肌肉脂质分子的HUFA占比与其饲料n-3 HUFA水平呈正相关性,HUFA优先沉积在磷脂中以及TAG的sn-2位置。二.基于转录组分析卵形鲳鲹肌肉HUFA沉积相关的基因利用饲料D1（鱼油对照组,2.30%n-3 HUFA）、D3（1.00%n-3 HUFA）和D6（2.10%n-3 HUFA）养殖8周后的鱼的肌肉样品进行转录组测序分析,结果显示,Illumina组装得到unigenes 126792个,其中47.78%基因得到注释。对获得的基因进行KEGG pathway功能富集分析的结果表明,代谢途径中富集的9698个基因主要集中在碳水化合物、氨基酸和脂质代谢等途径,其中脂质代谢途径中有1697个。在D1组比D3组和D6组比D3组中,脂质代谢途径中有119个均上调和113个均下调的基因,这些基因主要富集在磷脂、甘油三酯和鞘磷脂代谢途径中;催化甘油骨架sn-1、2、3位置酯化脂肪酸的甘油-3-磷酸脂酰转移酶（gpat）、酰基甘油-3-磷酸脂酰转移酶（agpat）和二脂酰甘油酰基转移酶（dgat）基因,以及磷脂合成中的溶血磷脂酰乙醇胺酰基转移酶（lpeat）和溶血酰磷脂酰基转移酶（lpgat）基因的表达水平均被上调。利用q PCR检测上述基因的表达水平,D1和D6组鱼肌肉的gpat4、agpat8、lpeat1和lpgat1的表达水平均显著高于D3组（P＜0.05）。以上结果表明,gpat4、agpat3、agpat8、lpeat1和lpgat1可能为卵形鲳鲹肌肉HUFA沉积相关基因。三.卵形鲳鲹HUFA沉积相关基因Agpat3的克隆、功能鉴定和表达调节克隆得到agpat3开放阅读框（ORF）1134bp,编码377个氨基酸。该基因在肝脏、肌肉、心脏、脑和腹腔脂肪等组织广泛表达,其中肝脏的表达水平最高;D4和D5饲料投喂组鱼肝脏或肌肉的agpat3表达水平显著高于D1（鱼油组）和D2组（P＜0.05）。在Hep G2和3T3L-1细胞中超表达agpat3,agpat3表达水平和HUFA（20:4n-6和22:6n-3）水平均显著高于对照组（P＜0.05）。克隆得到agpat3启动子序列2000bp,截成5段后分别构建超表达载体;将载体转染到HEK-293T和Hep G2中,利用双荧光素酶报告基因检测的实验结果表明,含有-436～+346bp片段的启动子活性最高,可能为其核心启动区。利用生物信息学对该核心启动区进行功能元件预测,得到CREB、GATA2、P53、Myo D、AP1、PPARγ、KLF5、C/EBPα、SRE、C/EBPβ和PPARα等结合元件;对这些结合元件分别进行点突变的实验结果表明,PPARγ和KLF5结合位点突变导致agpat3的启动子活力显著下降（P＜0.05）,而Myo D、C/EBPα、SRE、C/EBPβ和PPARα突变的结果相反（P＜0.05）,说明这些转录因子可能参与agpat3的表达调节。在HEK-293T和Hep G2中,Pparγ激动剂和抑制剂分别使agpat3启动子活力显著升高或降低,pparγ过表达也使agpat3启动子活力显著提高（P＜0.05）。以上结果表明,饲料n-3 HUFA水平影响卵形鲳鲹肝脏和肌肉agpat3的表达水平;体外细胞实验结果表明,agpat3可能参与HUFA沉积,而Pparγ对agpat3表达调节具有重要作用。总之,本论文的研究结果表明,投喂含有1.24-1.73%n-3 HUFA饲料的卵形鲳鲹获得较好的生长性能、生理生化指标和肌肉营养价值;肌肉TAG、PC和PE的HUFA占比与其饲料n-3 HUFA水平呈正相关性,HUFA优先沉积在磷脂中以及TAG的sn-2位置;肌肉TAG和磷脂代谢通路中,gpat4、agpat3、agpat8、lpeat1和lpgat1可能为HUFA沉积相关基因。饲料中n-3 HUFA水平影响鱼组织的agpat3表达水平,agpat3可促进HUFA的沉积;Pparγ对agpat3表达具有重要调节作用。研究成果为阐明鱼类肌肉HUFA沉积的特性及调控机制增加了新知识,可为改善养殖鱼类肌肉的营养价值提供依据。