研究目的 1.建立大鼠肾小球内皮细胞体外培养体系，为体外研究肾小球生物学行为提供细胞模型。 2.观察高糖与茶多酚对体外培养的人脐静脉内皮细胞氧化平衡、黏附分子和核转录因子(NF-κB)表达的影响，研究其中的信号转导机制，探讨糖尿病肾病发生、发展机制以及茶多酚对糖尿病肾病的防治作用。 3.通过比较经/未经高糖预处理的系膜细胞对内皮细胞影响的不同，证实在高糖条件下细胞间存在异常的相互作用，并探讨异常相互作用对糖尿病肾病发生、发展的影响。 研究方法 1.分离大鼠肾小球，并接种于铺有明胶底层的培养瓶中进行原代培养，通过免疫磁珠法(MACS)纯化内皮细胞，对培养的细胞进行形态学观察、直接免疫荧光法和免疫细胞化学法鉴定。 2.人脐静脉内皮细胞(ECV304)单层培养，分为正常对照组、高糖组、茶多酚干预组、茶多酚对照组，培养0h、12h、24h、36h、48h后，用分光光度比色法分别检测细胞上清液内GSH-PX活力、NO含量、NOS活力，用ELISA方法测定细胞上清液TGF-β1和膜表面ICAM-1蛋白表达，用RT-PCR测ICAM-1mRNA的表达，用免疫细胞化学法测细胞eNOS、iNOS表达以及采用WesternBlotting法测NF-κBp65的蛋白表达情况。 3.采用内皮细胞和系膜细胞双层共培养方法，建立两种细胞相互作用研究模型，分别用正常培养液和高糖培养液预处理系膜细胞24小时，后与内皮细胞共培养，分为正常组、高糖组、茶多酚干预组，继续培养24h和36h后，用分光光度比色法分别检测细胞上清液内GSH-PX活力、NO含量、NOS活力，用ELISA方法测定细胞上清液TGF-β1蛋白表达，用RT-PCR测ICAM-1mRNA的表达，以及采用WesternBlotting法测NF-κBp65的蛋白表达情况。 研究结果 1.获取的大鼠肾小球内皮细胞在体外可连续传代2～4代，生存40～50天；生长于明胶底层的细胞可形成管状结构；生长时融合呈鹅卵石样排列；免疫荧光染色CD34、Vimentin阳性；免疫细胞化学染色Keratin阴性，证实为大鼠肾小球内皮细胞。 2.内皮细胞单独培养时，各组培养上清液GSH-PX活力、NO含量、NOS活力和TGF-β1的值随培养时间的延长而升高，同时内皮细胞ICAM-1mRNA、膜表面ICAM-1和NF-κBp65的表达也随时间而升高。与正常组相比，高糖组的NO、NOS、TGF-β1、ICAM-1和NF-κB生成增加(P＜0.05)，GSH-PX活力下降(P＜0.05)；而茶多酚能显著干预高糖条件下内皮细胞的上述变化(P＜0.05)；茶多酚对照组与正常组相比无显著差异(P＞0.05)。 3.内皮细胞与系膜细胞共培养时，高糖预处理之高糖组NO含量、NOS活力、TGF-β1、ICAM-1和NF-κBp65值显著高于正常预处理之高糖组(P＜0.05)，GSH-PX活性降低(P＜0.05)。茶多酚能显著拮抗上述变化。 研究结论 1.成功建立肾小球内皮细胞体外培养方法。 2.高糖导致内皮细胞氧化失衡，降低抗氧化酶GSH-PX活力，促进NO、NOS产生及上调ICAM-1、TGF-β1表达，从而造成细胞损伤，参与了糖尿病肾病的发病机制。 3.当内皮细胞与系膜细胞共同培养时，高糖对内皮细胞的上述作用仍存在；经高糖刺激后的系膜细胞可使得与之共培养的内皮细胞活化，表现为共培养的GSH-PX活力下降以及NO、NOS、TGF-β1生成增多，内皮细胞内ICAM-1表达增加，表明高糖条件下内皮细胞与系膜细胞间存在异常的相互作用。 4.高糖可能通过NF-κB途径促进内皮细胞NO、ICAM-1、TGF-β1产生增加以及内皮细胞与系膜细胞间的异常相互作用。 5.茶多酚通过抑制NF-κB信号通路，促进GSH-PX产生及减少NO、NOS、TGF-β1和ICAM-1生成，具有明显的血管内皮保护作用；并能干预内皮细胞与系膜细胞在高糖环境下的异常相互作用，对糖尿病肾病起一定的防治作用。 6.内皮细胞与系膜细胞共培养模型，与普通单层培养相比可以更好地反映糖尿病肾病时肾小球内发生的病理生理过程。