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目的:原发性胆汁性胆管炎（Primary biliary cholangitis,PBC）是一种慢性胆汁淤积的自身免疫性疾病,主要累及肝内小叶间胆管。PBC在各年龄段均可发病,多集中在30-70岁,50岁为发病高峰,以女性居多,男女比例为1:9-10,是女性肝移植最常见的原因。PBC患者常有疲劳和顽固性的全身瘙痒等症状。30%的PBC患者可能发展到失代偿性肝病或死亡。随着自身抗体血清学检测的开展,以及我国人民对肝脏健康日益重视,中国可检出PBC患病人数也日渐增多,但我国现今还未进行全国范围的流行病学研究。而中国香港的调查发现,2015年PBC发病率达到百万分之82.3。PBC的主要病理学特点为外源性物质刺激易感人群的免疫系统,发生自身免疫反应,形成自身抗体复合物,从而特异性攻击肝内胆管上皮细胞,使肝内小胆管逐渐消失,肝内继而发生胆汁淤积,肝脏组织反复再生并逐渐纤维化,肝脏功能最终发生衰竭。基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus,GEO）是现今被广泛应用的高通量功能基因组数据的国际公共资源库。利用生物信息学的方法分析GEO数据库中已有的芯片数据,可筛选PBC肝组织或胆管上皮细胞的差异表达基因（Differentially Expressed Genes,DEGs）,从而寻找PBC发病或治疗的新靶点,而通过实验手段可对预测的结果进行验证。胆管结扎（Bile duct ligation,BDL）是一种常见的胆道梗阻手术,广泛应用于胆汁淤积和肝损伤研究的啮齿类动物模型。以BDL小鼠模型模拟PBC疾病的发生,可动态观察肝脏及肝内胆管上皮细胞发生的损伤,同时验证筛选出的靶基因在肝内胆管上皮细胞中的表达是否存在差异。肝内胆管上皮细胞（Intrahepatic biliary epithelial cells,i BECs）是肝细胞的重要组成部分,其损伤机制是研究PBC发病机制的关键。胆汁盐作为“细胞毒素”在肝脏组织中累积,在肝细胞坏死和肝纤维化发展过程中起关键的作用。本研究利用甘氨鹅脱氧胆酸（Glycochenodeoxycholate,GCDC）处理人肝内胆管上皮细胞系从而模拟PBC患者肝内胆汁淤积的环境,通过体外实验研究靶基因在PBC肝内胆管上皮细胞的损伤机制中所起的作用。转录因子与疾病的发生、进展密切相关,在基因表达调控中也起到重要的作用。本研究通过生物信息学的方法对靶基因启动子的转录因子进行预测,并通过体外实验来验证转录因子对靶基因启动子的调控,进而探索PBC肝内胆管上皮细胞的损伤机制。长链非编码RNA（Long non-coding RNAs,lnc RNAs）可参与调控细胞内的多种过程。lnc RNAs可作为一种结构组分与基因调控转录因子形成核酸蛋白复合体,同时还可与特定转录因子相结合,改变其在细胞内的定位,从而影响靶基因的转录。患者血浆中lnc RNAs表达水平异常可准确预测疾病的发生或进展。综上所述,本研究以动物模型验证生物信息学预测的靶基因,同时以人肝内胆管上皮细胞为研究对象,探索转录因子对靶基因启动子的调控作用机制,从而对胆汁酸诱导的肝内胆管上皮细胞损伤在PBC发病机制所起的作用做一阐述,并对PBC患者血浆中靶基因作为诊断和分期生物标志物的价值进行评估,为PBC发病机制、疾病监测和靶向治疗提供依据。研究对象:生物信息学分析包含来自GEO数据库的GSE79850和GSE29776芯片;小鼠模型:6-8周龄、雄性,SPF级C57BL/6J小鼠21只;选取在中国医科大学附属第一医院确诊的PBC患者145名,体检中心健康体检者110名,其中训练集包括80名PBC患者和60名健康对照者;验证集包括65名PBC患者和50名健康对照者;细胞系:人肝内胆管上皮细胞系、293T细胞系。研究方法:1、生物信息学分析（1）应用Gene Spring软件对GSE79850中PBC患者肝组织数据进行差异表达基因分析;对差异基因进行基因本体、通路富集和蛋白-蛋白相互作用网络分析,并在线进行文献挖掘;对PBC关键基因及其转录因子进行分析;（2）对GSE29776芯片中BDL组与sham组小鼠肝脏差异表达基因进行分析;（3）qRT-PCR法在PBC患者和健康对照者血浆中筛选并验证差异表达基因。2、靶基因在BDL小鼠模型中的验证（1）BDL小鼠模型的建立:实验（BDL）组行胆总管结扎术;假手术（sham）组开腹后游离胆总管随即缝合;分别在术后5天、10天和15天处死小鼠取肝脏组织,行HE和Masson染色,观察肝组织纤维化程度,选取最佳建模时间;（2）免疫荧光双标记法检测BDL小鼠肝组织中肝内胆管上皮细胞CK19和S100a6蛋白,验证生物信息学的预测。3、S100A6在GCDC处理后人肝内胆管上皮细胞中的生物学功能（1）GCDC处理人肝内胆管上皮细胞时间和浓度的筛选:分别用200μM、500μM和1000μM GCDC处理人肝内胆管上皮细胞,分别培养2小时、6小时和24小时后用流式细胞仪检测细胞凋亡百分率,选取统计学差异最大的浓度和培养时间作为后续实验的条件;（2）免疫组化法检测CK19蛋白鉴定人肝内胆管上皮细胞;（3）qRT-PCR和Western Blotting法检测S100A6过表达质粒和Smart silencer转染人肝内胆管上皮细胞的干扰效率;（4）流式凋亡检测S100A6对人肝内胆管上皮细胞凋亡能力的影响;（5）CCK8法检测S100A6对人肝内胆管上皮细胞增殖水平的影响。4、转录因子ESR1对S100A6启动子的调控作用（1）qRT-PCR法检测ESR1对Hi BECs中S100A6 mRNA表达的影响;（2）Western Blotting法检测转录因子ESR1对Hi BECs中S100A6和PDC-E2蛋白表达的影响;（3）双荧光素酶报告基因实验验证ESR1对S100A6启动子的调控作用;（4）S100A6干扰质粒转染过表达ESR1的Hi BECs细胞,流式凋亡检测细胞凋亡水平;CCK8法检测细胞增殖水平。5、血浆S100A6和相关lnc RNAs作为生物标志物在PBC诊断和分期中的价值（1）生物信息学方法预测与S100A6相关的lnc RNAs;（2）qRT-PCR法检测PBC患者及健康对照者血浆S100A6 mRNA和lnc RNAs的相对表达量;（3）ROC曲线评价S100A6和相关lnc RNAs在PBC诊断和分期中的价值。研究结果:1、生物信息学分析结果（1）PBC患者肝脏组织生物信息学分析（a）对GSE79850中PBC患者与对照组肝组织基因表达谱进行比较分析,共得到77个DEGs（P<0.05,且FC>2.0）,其中包含47个上调DEGs和30个下调DEGs;（b）GO富集分析:所有DEGs均显著富集在生物过程（BPs）。表达上调的DEGs主要富集于免疫应答、细胞因子应答和细胞因子刺激应答;表达下调DEGs主要富集于免疫防御、炎症反应和细胞因子应答;（c）通路分析:表达上调DEGs主要富集在A型流感和单纯疱疹病毒感染通路;表达下调DEGs主要富集在肿瘤坏死因子（TNF）信号通路和NF-k B信号通路;（d）选取STRING分析中PPI分数>0.4的数据,获得74个节点和356个蛋白质对;簇分析得到了两个MCODE评分>3的簇;（e）对PPI网络中得分大于10的基因进行文献挖掘,得到27个在细胞活化、先天免疫应答和免疫系统方面富集于先前报道的基因构建共引网络;（f）DEGs中发现在CTD中列出的3个与PBC相关的关键基因,包括CCL5、IL7R和TNFRSF1A;同时分析出5个转录因子并构成转录调控网络。（2）BDL小鼠模型肝内胆管上皮细胞差异基因筛选:在30名PBC患者和30名健康对照者血浆中用qRT-PCR法检测差异表达上调基因mRNA,发现S100A6变化最大（t=20.28,P<0.0001）。2、BDL小鼠模型的建立及差异基因的鉴定（1）BDL组小鼠肝脏组织病理学大体符合肝纤维化改变;（2）HE染色:BDL组与sham组、健康对照组小鼠肝组织相比,汇管区炎性细胞计数显著增多（P<0.05）;（3）Masson染色:BDL组小鼠肝组织汇管区周边发生Ι型胶原纤维化、纤维间隔形成、纤维间隔伴小叶结构紊乱、肝硬化;sham组小鼠肝组织状况良好,无纤维化出现;（4）免疫荧光双标记结果显示,CK19和S100a6蛋白在BDL小鼠肝内胆管上皮细胞均有阳性表达,sham组小鼠肝内胆管上皮细胞中这两种蛋白仅有微弱表达;3、S100A6促进Hi BECs细胞凋亡、抑制细胞增殖（1）与NC组相比,S100A6在GCDC处理后Hi BECs中表达水平显著升高（P<0.05）;（2）与NC组相比,转染S100A6 Smart silencer后,Western Blotting结果显示,Hi BECs细胞系中PDC-E2蛋白表达显著下降（P<0.05）;转染S100A6过表达质粒后,Hi BECs细胞系中PDC-E2蛋白表达显著升高（P<0.05）;（3）与NC组相比,转染S100A6 Smart silencer后,CCK8实验结果显示:Hi BECs细胞增殖能力显著升高（P<0.05）;转染S100A6过表达质粒之后,细胞增殖能力显著降低（P<0.05）;（4）与NC组相比,转染S100A6 Smart Silencer之后,流式凋亡结果显示,Hi BECs细胞凋亡水平显著降低（P<0.05）;转染S100A6过表达质粒之后,Hi BECs细胞凋亡水平显著升高（P<0.05）;4、转录因子ESR1通过激活S100A6启动子促进Hi BECs凋亡、抑制细胞增殖（1）与NC组相比,ESR1在GCDC处理后Hi BECs中的表达水平显著升高（P<0.05）;（2）ESR1过表达质粒转染Hi BECs后,细胞中S100A6 mRNA相对表达量显著升高（P<0.05）;ESR1 Smart silencer转染Hi BECs后,细胞中S100A6 mRNA相对表达量显著降低（P<0.05）;（3）Western Blotting法检测Hi BECs中ESR1过表达或敲减后S100A6、PDC-E2和ESR1蛋白表达水平。过表达ESR1后,GCDC组与正常组相比,S100A6、PDC-E2和ESR1蛋白表达都上调（P<0.05）;GCDC+ESR1-OE组S100A6、PDC-E2和ESR1蛋白表达量显著高于其他组（P<0.05）;敲减ESR1后,GCDC组与正常组相比,S100A6、PDC-E2和ESR1蛋白表达都下调（P<0.05）;GCDC+ESR1-KD组S100A6、PDC-E2和ESR1蛋白表达量显著低于其他组（P<0.05）;（4）双荧光素酶报告基因实验结果表明,野生型p GL3 basic-S100A6的活性在ESR1过表达组中显著升高,而点突变法构建突变体p GL3 basic-S100A6-Luci在ESR1过表达组无明显改变;（5）S100A6干扰质粒转染过表达ESR1的Hi BECs,与control+si-control组相比,ESR1+si-control组Hi BECs细胞凋亡百分率较对照组和ESR1+S100A6-si组显著升高（P<0.05）,细胞增殖水平显著降低（P<0.05）;5、S100A6及相关lnc RNAs作为PBC诊断和分期标志物的评估（1）LncRNAs的筛选:通过生物信息学方法筛选出于S100A6相关的lnc RNAs LINC00312、LINC00472和LINC01257;（2）PBC患者血浆中Log10 ESR1和S100A6 mRNA相对表达量呈正相关（r=0.367,P=0.001）;（3）PBC患者血浆中S100A6 mRNA、log10 LINC00472和LINC1257相对表达量与健康对照者相比,相对表达显著升高（P<0.0001）;LINC00312的相对表达水平显著低于健康对照者（P<0.0001）;（4）PBC晚期与健康对照者（P<0.0001）和PBC早期（P<0.0001）相比,S100A6 mRNA表达上调;PBC早期S100A6 mRNA水平高于HCs（P=0.03）;与HCs相比,LINC01257在早期和晚期PBC相对表达均上调（P<0.0001）。PBC晚期LINC00312表达水平低于PBC早期和HCs（P=0.01,P<0.0001）;同时,LINC00312在早期PBC表达水平低于HCs（P<0.0001）;晚期PBC log10 LINC00472的表达水平高于早期PBC（P<0.0001）和HCs（P<0.0001）;（5）PBC诊断S100A6、LINC00312、log10 LINC00472、LINC01257的曲线下面积（AUC）分别为0.759、0.7292、0.6942、0.7158;对于PBC分期的判断曲线下面积（AUC）分别为0.666、0.661、0.839和0.5549;（6）S100A6 mRNA相对表达水平与log10 LINC00472呈正相关（r=0.683,P<0.0001）;血清C-IV水平与log10 LINC00472的相对表达水平呈正相关（r=0.482,P<0.0001）;S100A6 mRNA的相对表达水平与血清C-IV水平呈正相关（r=0.732,P<0.0001）;（7）采用配对t检验分析比较治疗一年前后这4个基因的表达水平变化,S100A6 mRNA、log10 LINC00472、LINC01257的相对表达量均显著降低（P值分别为0.0018、0.036和0.0006）;与治疗前相比,LINC00312治疗后的相对表达量显著增加（P=0.0007）;（8）根据log10 LINC00472 cutoff值（2.33）的相对表达水平进行分组,PBC患者在L1亚组中,S100A6 mRNA的相对表达量和血清C-IV水平较低（P<0.0001）;同时,L1组中LINC01257的相对表达量高于L2亚组（P=0.005）;（9）以独立的PBC队列数据构建ROC曲线验证生物标志物预测的PBC诊断和分期的价值。S100A6 mRNA、LINC00312、log10 LINC00472和LINC01257对PBC诊断的曲线下面积（AUC）分别为0.769、0.772、0.755和0.695;log10 LINC00472对PBC分期的曲线下面积为0.835。结论:1、CCL5、IL7R、TNFRSF1A基因和免疫应答通路以及分子模拟可能在PBC发病机制中发挥重要作用。这些基因和通路可能成为治疗PBC的新靶点;2、S100a6在胆汁淤积小鼠模型肝内胆管上皮细胞表达上调;3、S100A6基因能够促进胆汁淤积人肝内胆管上皮细胞凋亡,同时抑制其细胞增殖,在胆汁淤积胆管上皮细胞损伤中起到重要作用;4、转录因子ESR1通过激活S100A6启动子促进人肝内胆管上皮细胞凋亡,并抑制其细胞增殖;5、ESR1/S100A6信号通路在PBC胆汁淤积肝内胆管细胞损伤中起到重要作用;6、PBC患者血浆中S100A6 mRNA、LINC00312、LINC00472和LINC01257可作为PBC诊断的潜在生物标志物,LINC00472可作为PBC分期的潜在生物标志物。