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系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种富含自身抗体抗原的自身免疫性疾病。现我国罹患SLE者大于一百万人,居全球之首。至今,SLE的发病机制和治疗靶点尚不明确。因此,探究SLE的发病机制和寻找靶向治疗药物成为一项重要医学研究课题。中性粒细胞外网状陷阱(neutrophil extracellular trap,NET)是中性粒细胞受刺激后释放到细胞外的网状结构。近期研究发现NET在SLE发病过程中发挥重要作用,抑制NET形成有望成为治疗SLE的新靶点。沙利度胺(thalidomide,Thd)可有效改善SLE患者皮肤损伤等症状。NET在SLE皮损中起重要致病作用,但Thd是否影响NET形成尚不清楚。因此,本研究通过体外实验探究Thd对SLE中NET形成和NET相关炎性血管生成的影响,从而进一步揭示Thd治疗SLE的作用机制。具体的研究内容分为以下3部分:第一部分:Thd对中性粒细胞NET形成的影响目的:明确Thd对炎性因素诱导的健康人中性粒细胞NET形成和SLE中性粒细胞自发NET形成的影响。方法:(一)Thd对炎性因素诱导的健康人中性粒细胞NET形成的影响:提取健康人中性粒细胞,流式细胞学法鉴定中性粒细胞的纯度。CCK-8法检测不同浓度Thd对中性粒细胞的细胞活性影响。分别用PBS(对照),50ug/ml Thd或100ug/ml Thd预孵育中性粒细胞1小时。然后用PBS,20n M佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA),250ug/ml SLE IgG,或1%SLE血清(含250ug/ml IgG),分别刺激中性粒细胞2小时。免疫荧光法定性分析和ELISA法定量分析各组NET形成结果。(二)Thd对SLE中性粒细胞自发NET形成的影响:提取SLE患者中性粒细胞和健康人中性粒细胞,分别用PBS,50ug/ml Thd或100ug/ml Thd预孵育中性粒细胞1小时,不加刺激再孵育2小时。免疫荧光法定性分析和ELISA法定量分析各组NET形成结果。结果:1.流式检测证实提取中性粒细胞纯度达90%以上。2.CCK8法结果显示Thd(≤150ug/ml)不影响中性粒细胞的细胞活性。3.免疫荧光法结果显示与对照组相比,SLE IgG组(P<0.001)和SLE血清组(P<0.001)的NET形成增多,且血清组比IgG组的NET形成增多(P<0.001)。4.免疫荧光法和ELISA法结果均提示与PMA组相比,PMA+Thd50ug/ml组(P<0.001)和PMA+Thd100ug/ml组(P<0.001)的NET形成减少,且PMA+Thd100ug/ml组比PMA+Thd50ug/ml组的NET形成少(P<0.001)。5.免疫荧光法结果显示与SLE血清组相比,SLE血清+Thd50ug/ml组(P<0.001)和SLE血清+Thd100ug/ml组(P<0.001)的NET形成减少,且SLE血清+Thd100ug/ml组比SLE血清+Thd50ug/ml组的NET形成少(P<0.001)。6.免疫荧光法和ELISA法结果均显示SLE中性粒细胞比健康人中性粒细胞自发形成的NET显著增多(P<0.001),且Thd可有效抑制SLE自发NET形成(SLE中性粒细胞+Thd组vs SLE中性粒细胞组,P<0.001)。结论:SLE血清中,除IgG外其他因素也参与NET形成。Thd既可以抑制PMA和SLE血清诱导的健康人中性粒细胞NET形成,也可以抑制SLE中性粒细胞自发NET形成。第二部分:Thd抑制NET形成的信号通路机制目的:有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路在NET形成中发挥重要作用。p38 MAPK和细胞外信号调节激酶(extracellular-signal-regulated kinase,ERK)1/2在NET形成过程中被激活。明确Thd能否通过影响p38和ERK1/2的激活,从而抑制NET形成。方法:(一)Thd通过影响p38和ERK1/2激活,从而抑制PMA/SLE血清诱导健康人中性粒细胞NET形成:提取健康人中性粒细胞。用PBS或100ug/ml Thd预孵育中性粒细胞。然后用PBS,20n M PMA或1%SLE血清,分别刺激中性粒细胞。Western blot法检测各组p-p38,p-ERK1/2,GAPDH的蛋白水平。(二)Thd通过影响p38和ERK1/2激活,从而抑制SLE中性粒细胞NET形成:提取SLE患者和健康人中性粒细胞(对照)。用PBS或100ug/ml Thd预孵育中性粒细胞。不加刺激再孵育。Western blot法检测各组p-p38,p-ERK1/2,GAPDH的蛋白水平。结果:1.PMA组的p38和ERK1/2的磷酸化水平较对照组显著升高(P<0.01)。PMA+Thd组的p38和ERK1/2磷酸化水平较PMA组显著降低(P<0.01)。2.SLE血清组的p38和ERK1/2的磷酸化水平较对照组明显升高(P<0.01)。SLE血清+Thd组的p38和ERK1/2磷酸化水平较SLE血清组明显降低(P<0.01)。3.SLE中性粒细胞组比健康人中性粒细胞组的p38和ERK1/2磷酸化水平明显升高(P<0.01)。SLE中性粒细胞+Thd组的p38和ERK1/2磷酸化水平比SLE中性粒细胞组水平显著降低(P<0.01)。结论:SLE中性粒细胞的MAPK信号通路比健康人中性粒细胞更活化。NET形成与MAPK信号通路相关,Thd通过抑制MAPK信号通路抑制NET形成。第三部分:明确Thd对NET相关炎性血管生成的影响目的:研究表明SLE患者炎性血管生成增多。通过观察内皮细胞迁移和管形成,本研究探讨SLE中性粒细胞自发NET能否促进炎性血管生成,以及探究Thd对SLE自发NET相关炎性血管生成的影响。方法:(一)SLE中性粒细胞自发NET对炎性血管生成的影响人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)细胞培养(3~5代)。提取SLE患者中性粒细胞自发形成NET。Pico Green ds DNA荧光法定量NET中DNA水平。Transwell法观察SLE中性粒细胞自发NET对HUVEC迁移的影响。下室放入培养基。上室放入HUVEC及各种刺激因素:PBS(对照)或NET。培养24小时后观察内皮细胞迁移结果。小管形成实验法检测SLE中性粒细胞自发NET对HUVEC管形成的影响。HUVEC分成2组,分别加入PBS(对照)和NET。培养4小时后观察内皮细胞管形成。(二)Thd对SLE自发NET相关炎性血管生成的影响:HUVEC细胞培养(3~5代)。CCK-8法检测Thd对HUVEC的细胞活性影响。Transwell法观察Thd对SLE自发NET诱导的HUVEC迁移的影响。下室放入培养基。上室放入HUVEC及各种刺激因素:PBS(对照)、NET或NET+Thd。培养24小时后观察内皮细胞迁移结果。小管形成实验法检测Thd对SLE自发NET诱导的HUVEC管形成的影响。HUVEC分成3组,分别加入PBS(对照),NET和NET+Thd,培养4小时后观察内皮细胞管形成。结果:1.CCK-8法检测提示Thd(≤150ug/ml)对HUVEC细胞活性无影响。2.Transwell法结果显示NET组比对照组HUVEC迁移的细胞数明显增多(P<0.01)。小管形成实验法结果提示NET组比对照组HUVEC形成的管长、环数、分支点数明显增多(P<0.01)。3.Transwell法结果显示与NET组相比,NET+Thd组HUVEC迁移的细胞数显著减少(P<0.01)。小管形成实验法结果提示NET+Thd组比NET组HUVEC形成的管长、环数、分支点数显著减少(P<0.01)。结论:SLE中性粒细胞自发形成的NET可以促进内皮细胞炎性血管生成。且这种血管生成可以被沙利度胺所抑制。