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目的:支气管肺发育不良（Bronchopulmonary dysplasia,BPD）是一种由遗传环境因素引起的疾病,目前仍是影响早产儿预后的主要疾病之一。BPD现在被认为是发育中的肺部对产前损伤和重复性产后损伤产生的一种异常修复反应的结果,它以肺泡发育阻滞以及肺血管发育不良为主要病理改变,会导致患者在童年期和成年期呼吸系统和心血管系统疾病风险增加,并且它与早产儿视网膜病变、发育迟缓、脑瘫等疾病有关,严重影响患儿的生存质量。目前BPD尚没有有效的治疗手段,因此继续深入了解肺泡损伤修复的机制以便于对BPD进行早期干预对于改变这种复杂疾病的严重程度和预后具有重要意义。肺泡是由Ⅰ型肺泡上皮细胞（Type Ⅰ alveolar epithelial cells,AEC-Ⅰ）和Ⅱ型肺泡上皮细胞（TypeⅡalveolar epithelial cells,AEC-Ⅱ）组成的,AEC-Ⅰ是肺远端损伤的靶点,以水通道蛋白5（Aquaporin 5,AQP5）作为表面标记;而AEC-Ⅱ则作为肺泡上皮细胞的干细胞存在,以表面活性蛋白C作为表面标记（Surfactant protein C,SPC）。与肺部其他上皮细胞相似,肺泡上皮细胞在正常情况下表现出相对较慢的细胞更替速度（约28-35天）。然而,在高氧、NO2、臭氧和博莱霉素等物质损伤后,AEC-Ⅱ可以迅速增殖并分化为AEC-Ⅰ完成肺上皮的修复和肺泡重塑。肺发育和肺损伤修复涉及多种细胞信号转导通路的复杂调控,我们课题组前期在关于BPD的研究中（国家自然科学基金,项目批号:81270726）发现高氧7天后Wnt/β-catenin通路过度激活,导致SPC表达显著升高而AQP5表达降低,证明在BPD中存在AEC-Ⅱ过度增殖而分化障碍。研究报道抑制Wnt/β-catenin信号通路可减轻新生儿高氧诱导的肺损伤,因此我们试图寻找其上游能够调控其激活的靶位基因从而对其进行早期干预。本课题组在对脂多糖（LPS）诱导急性肺损伤（Acute lung injury,ALI）的RNA测序中发现多种长链非编码RNA（Long non-coding RNA,LncRNA）、微小RNA（micro RNA,miRNA）和信使RNA（message RNA,m RNA）的表达发生改变。其中,LncRNA生长阻滞特殊转录本5（Growth arrest-special transcript 5,GAS5）表达水平发生下调,它能够通过影响细胞周期进展进而调控细胞的增殖和分化。在急性肺损伤中过表达GAS5能够抑制炎症反应减少细胞凋亡,并且研究报道GAS5过表达能够抑制冠状动脉疾病大鼠心肌组织Wnt/β-catenin信号通路的异常激活从而对心肌细胞起到保护作用。那么,在BPD的慢性肺损伤过程中GAS5是否也可以通过某些环节调控Wnt/β-catenin信号通路的激活状态呢?我们在前期关于LPS诱导的急性肺损伤的研究中发现m RNA Sox9的表达发生改变。性别决定区Y（Sry）盒家族转录因子9（Sex-determined region Y（Sry）box family transcription factors 9,Sox9）在胚胎发育过程中动态表达,对性别决定、软骨发育、髓鞘形成、视网膜发生、及消化道器官发育起到重要的调控作用。在肺发育过程中,它通过多种信号通路调控正常的分支形态发生和肺上皮的发育,抑制肺泡化过早启动,在成体组织气道远端祖细胞表达并维持其正常功能。目前Sox9对肺损伤后肺泡上皮修复的影响尚存争议,但已有研究证实它能够影响急性肺损伤后肺功能的恢复,并且研究报道Sox9在多种生理病理过程中对Wnt/β-catenin信号通路具有激活或抑制作用,但目前对于其在BPD中对AEC-Ⅱ分化及对Wnt/β-catenin通路的影响研究甚少。我们前期的实验证实GAS5与Sox9表达具有相关性,Sox9很可能是GAS5下游的效应蛋白。我们通过miRNA database、Targetscan数据库等生物信息网络筛选出可能与LncRNA GAS5及Sox9存在结合位点的miRNA包括:miR-18a-5p、miR-1912-3p、miR-200b-3p、miR-450b-5p等11个miRNA,结合在LPS致急性肺损伤中的基因组分析构建了LncRNA GAS5/miR-1912-3p/Sox9的ce RNA表达通路,试图揭示其在BPD中对AEC-Ⅱ分化的影响以及与Wnt/β-catenin通路的作用关系。本研究分别从细胞及动物水平,应用qRT-PCR、Western Blot、免疫荧光、流式细胞术等多种实验方法,检测BPD大鼠肺组织及AEC-Ⅱ中相应指标的表达变化,并在此基础上进行基因表达干预,验证目的基因间的调控关系及对AEC-Ⅱ细胞分化的影响,初步探讨了其与Wnt/β-catenin信号通路的关系,有利于寻找BPD的早期干预的新靶点。研究方法:1、构建实验模型:（1）动物模型:将SD新生大鼠于生后12h内随机分为常氧对照组（Normoxic control group,N）与高氧模型组（Hyperoxic model group,H）,对照组饲养于空气中（21%O2）,模型组饲养于高氧玻璃箱内（85%O2）,分别于入组后1d、3d、7d、14d、21d随机选取仔鼠10只,收集肺组织,用于后续实验。（2）体外细胞模型:将RLE-6TN细胞系传代后分为对照组与模型组,对照组置于普通孵箱（21%O2;5%CO2）中培养,模型组置于高氧孵箱（85%O2;5%CO2）中培养,于48h收集细胞用于后续实验。（3）原代细胞模型:提取新生SD大鼠原代AEC-Ⅱ接种于培养皿中,对照组置于普通孵箱（21%O2;5%CO2）中培养,模型组置于高氧孵箱（85%O2;5%CO2）中培养,分别于24h、48h或72h收取细胞用于后续实验。2、实验方法及检测指标:（1）动物模型评估:组织石蜡切片HE染色观察大体组织病理改变。（2）观察GAS5与Sox9、SPC、AQP5表达的相关性:（1）应用qRT-PCR检测动物模型和体外细胞模型中GAS5、Sox9、SPC、AQP5的RNA表达水平;（2）Western Blot检测动物模型和体外细胞模型中Sox9、SPC、AQP5的蛋白表达水平;（3）Sox9+SPC、Sox9+AQP5免疫荧光染色检测动物模型中Sox9在AEC-Ⅱ和AEC-Ⅰ中的表达;（4）验证GAS5对Sox9的调控作用:在体外细胞模型中应用siRNA、过表达质粒干预GAS5后检测Sox9的RNA和蛋白表达水平变化;在体外细胞模型中应用siRNA、过表达质粒干预Sox9后检测GAS5的RNA表达水平变化;在原代细胞模型中应用siRNA、过表达质粒干预GAS5表达后进行细胞爬片,Sox9+SPC、Sox9+AQP5免疫荧光染色观察Sox9在AEC-Ⅱ和AEC-Ⅰ中的荧光强度变化;（5）观察Sox9的核浆分布:在体外细胞模型中提取核浆分离蛋白,应用Western Blot检测Sox9的核浆表达变化;在原代细胞模型中进行Sox9+SPC、Sox9+AQP5免疫荧光染色观察Sox9在AEC-Ⅱ和AEC-Ⅰ中的表达位置变化;（6）观察Sox9对AEC-Ⅱ增殖和分化的影响:在体外细胞模型中应用siRNA、过表达质粒干预Sox9后通过qRT-PCR和Western Blot检测SPC的RNA和蛋白水平;在原代细胞模型中应用siRNA、过表达质粒干预Sox9后通过流式细胞计数检测AEC-Ⅱ和AEC-Ⅰ的细胞数目变化。（3）验证GAS5/miR1912-3p/Sox9的调控关系:（1）应用qRT-PCR检测动物模型和体外细胞模型中miR-1912-3p的RNA表达水平;（2）在体外细胞模型中应用miRNA模拟物mimics和miRNA抑制物inhibitor干预miR-1912-3p的表达水平,通过qRT-PCR和Western Blot分别检测GAS5和Sox9的RNA或蛋白表达变化;（3）在体外细胞模型中应用siRNA和过表达质粒干预GAS5和Sox9的表达,通过qRT-PCR检测miR-1912-3p的RNA表达水平;（4）在体外细胞模型应用过表达质粒和mimics进行GAS5和miR-1912-3p的共转染,通过Western Blot检测Sox9的蛋白水平;（5）在原代细胞模型中应用miRNA模拟物mimics和miR抑制物inhibitor干预miR-1912-3p的表达后进行细胞爬片,Sox9+SPC、Sox9+AQP5免疫荧光染色观察Sox9在AEC-Ⅱ和AEC-Ⅰ中的荧光强度变化;（6）双荧光素酶报告验证GAS5与miR-1912-3p、miR-192-3p与Sox9的结合位点。（4）观察GAS5/miR1912-3p/Sox9对β-catenin表达的影响:（1）应用qRT-PCR和Western Blot检测动物模型和体外细胞模型中β-catenin的RNA和蛋白表达水平;（2）在体外细胞模型中应用siRNA和过表达质粒干预GAS5和Sox9的表达,通过qRT-PCR和Western Blot检测β-catenin的RNA和蛋白表达水平;（3）在体外细胞模型中应用mimics和inhibitor干预miR-1912-3p的表达水平,通过qRT-PCR和Western Blot检测β-catenin的RNA和蛋白表达水平;（4）在原代细胞模型中应用siRNA、过表达质粒干预Sox9表达后进行细胞爬片,β-catenin+SPC免疫荧光染色观察β-catenin在AEC-Ⅱ中的荧光强度;（5）在体外细胞模型中提取核浆分离蛋白,应用Western Blot检测β-catenin的核浆表达变化;（6）在体外细胞模型中应用过表达质粒干预Sox9表达后提取核浆分离蛋白,应用Western Blot检测β-catenin的核浆表达变化。3、统计学分析:实验获得数据采用Graph Pad Prism 7.0软件进行统计分析,结果数据以均值±标准差（Mean±SD）的方式表示,模型组与对照组间采用独立样本t检验分析,多组间比较采用单因素方差分析（ANVOA）,P＜0.05为差异具有统计学意义。结果:1、在BPD中GAS5和Sox9表达水平变化对AEC-Ⅱ增殖和分化的影响研究:（1）动物模型建立:HE染色和RAC值显示随着高氧暴露时间延长模型组出现肺泡化阻滞。（2）BPD动物模型中肺泡上皮标记物SPC和AQP5表达水平发生改变,与对照组相比,模型组SPC的表达升高,在7d、14d、21d差异具有显著性（P＜0.001）;模型组AQP5的表达在1-3天略增高,但无统计学意义,在7d、14d、21d表达降低,差异具有显著性（P＜0.001）。（3）BPD中GAS5和Sox9表达水平发生改变,模型组LncRNA GAS5表达明显增高,并逐渐降低;模型组Sox9的表达在1-3天高于对照组,7天后逐渐下降低于对照组,总体呈下降趋势,与GAS5的表达正相关。（4）荧光双染显示模型组7天后SPC表达明显增多,荧光信号增强,AQP5表达减少,荧光信号减弱,Sox9在1d和3d荧光信号增强,7天后逐渐减弱。（5）体外细胞模型中,Sox9、GAS5、SPC表达升高。（6）BPD中敲减GAS5能够降低Sox9表达水平,过表达GAS5能够促进Sox9表达。（7）BPD中Sox9在高氧诱导下总蛋白表达增加,核内表达减少,浆内表达增加。（8）BPD中Sox9过表达能够促进AEC-Ⅱ增殖并向AEC-Ⅰ分化。2、在BPD中GAS5通过miR-1912-3p调控Sox9表达变化的机制研究:（1）动物模型中miR-1912-3p的表达在1-3天低于对照组,7天后明显上升高于对照组,模型组总体呈上升趋势,与Sox9的表达呈负相关。（2）体外细胞模型中miR-1912-3p表达减低。（3）Sox9是miR-1912-3p的下游靶基因。（4）GAS5能够下调miR-1912-3p的表达。（5）GAS5通过抑制miR-1912-3p起到对Sox9的上调作用。（6）GAS5与miR-1912-3p、miR-192-3p与Sox9存在结合位点。3、BPD中GAS5/miR-1912-3p/Sox9对Wnt/β-catenin信号通路的影响研究:（1）BPD中模型组β-catenin在1-3天表达略减低,随后逐渐升高,至7天两组表达无统计学意义,14～21天则表达明显升高。（2）体外细胞模型中β-catenin表达降低。（3）体外细胞模型中GAS5和Sox9能够抑制β-catenin表达,miR-1912-3p能够促进β-catenin表达。（4）原代细胞模型中Sox9能够抑制β-catenin表达。（5）BPD中β-catenin在高氧诱导下总蛋白表达减少,核内表达增加,浆内表达减少。（6）BPD中Sox9过表达能够使β-catenin核内表达减少,胞浆内表达增加。结论:1、在BDP中LncRNA GAS5表达升高,它能够促进Sox9的表达;BPD早期Sox9表达增高,同时核表达减少,促进AEC-Ⅱ向AEC-Ⅰ快速的分化。2、在BPD中LncRNA GAS5能够作为miR-1912-3p的分子海绵与其结合,从而促进miR-1912-3p下游靶基因Sox9的表达。3、BPD中LncRNA GAS5/miR1912-3p/Sox9能够降低β-catenin的整体表达水平,并减少β-catenin的核内表达,抑制Wnt/β-catenin信号通路过度激活。