论文部分内容阅读
精原干细胞的高效分离纯化与体外培养为精原干细胞的移植、多潜能性分化、体外诱导分化和转基因动物研究等多项研究奠定良好的基础,在医学、生物学和生物技术研究领域有着极其可贵的潜在价值。本研究以7d雄性昆系小鼠为试验材料,对小鼠精原干细胞进行分离、纯化、鉴定、培养和冷冻研究,以期获得纯度较高的分离纯化方法以及高效的培养方法和冻融技术,从而为男性不孕症的治疗和濒危物种的保护等提供一定的依据。本研究主要获得以下结果:1.小鼠精原干细胞大多以4细胞链、8细胞链和16细胞链的典型状态存在,从形态学上可以进行初步确定;碱性磷酸酶(AKP)存在小鼠精原干细胞的表面,用NBT/ BCIP试剂盒染色后,倒置显微镜下观察时可以看到棕褐色或蓝紫色的细胞,即为小鼠精原干细胞;对Beta-actin和Ngn3两个基因进行RT-PCR及凝胶电泳试验,由于Ngn3基因在支持细胞中无表达,凝胶电泳试验时没有条带,据此差异可以确定小鼠精原干细胞。本研究初步建立了小鼠精原干细胞形态学、碱性磷酸酶(AKP)染色和Ngn3基因鉴定的综合鉴定方法。2.表皮促生长因子(EGF)、胰岛素样促生长因子-1(IGF-1)和碱性成纤维细胞促生长因子(bFGF)在单独使用、两两配伍和三因子共同配伍的条件下,采用预先处理和后处理的方法培养小鼠精原干细胞时,10% FSH (30 ng/ml)预先处理组单因子EGF(10ng/ml)能够明显促进小鼠精原干细胞增殖,其增殖率分别为41.60%;用10% FSH (30 ng/ml)预后处理双因子IGF-1(20 ng/ml)和bFGF(20 ng/ml)组以及用10% FSH(30 ng/ml)的预后处理三因子EGF(20 ng/ml)、IGF-1(20 ng/ml)和bFGF (10ng/ml)组均能促进小鼠精原干细胞的大量增殖,其增殖率分别63.00%和56.60%。3.低密度脂蛋白、海藻糖和卵磷脂三种冷冻保护剂在单独使用和两两配伍条件时,3mg/ml低密度脂蛋白单独使用、3mg/ml低密度脂蛋白和0.5mg/ml的卵磷脂配伍条件时小鼠精原干细胞的冷冻复苏率显著高于其它组(p <0.05),分别达到87.16%和90.23%,低密度脂蛋白和卵磷脂配伍有利于精原干细胞的冷冻保存。另外,-80℃超低温冰箱冷冻效果整体上要高于液氮冷冻。4.低密度脂蛋白、卵磷脂、海藻糖作为冷冻保护剂用于小鼠支持细胞的冷冻保存,分别于第1d、7d和15d检测复苏率。其中第7d时的效果最好,低密度脂蛋白、卵磷脂和海藻糖三组中的支持细胞复苏率分别为70.65%、72.86%和68.25%,显著高于其他组(p <0.05)。