前言:高盐饮食在盐敏感性高血压、糖尿病及自身免疫性疾病等的发病中有着重要的作用。其中,在盐敏感性高血压的发病中,遗传性细胞膜离子转运缺陷、肾脏排钠作用障碍、钠离子代谢异常、钠的摄入增加、钠通道的变异及免疫系统异常继而造成的一系列参与血压调控的病理生理改变是其发病的主要机制。美国疾病控制和预防中心(CDC)和美国心脏协会(AHA)注意到高钠和高血压相关,并能够增加心肌梗塞、中风和死亡。AHA建议个人饮食中摄入钠不要多1500mg/天;CDC2010年的联邦饮食指南推荐个人饮食的盐摄入量是少于2300mg/天,而对于51岁或者更老的人,高血压人群,糖尿病患者,慢性肾脏疾病患者和心力衰竭应该减少日常的盐摄入量到1500mg/天。但是医学研究所(IOM)的一份报告发现,没有证据表明在个人的饮食大大减少盐和它所包含的钠,可以减少高血压患者心肌梗塞、中风或死亡的风险。合理的钾摄入具有对抗高盐饮食对人体健康的影响已被确认,但其机制并不清楚。人体钠、钾的吸收、分布以及排泄和再吸收主要由细胞膜上的钠/钾离子通道等完成,而钠/钾离子通道的活化受很多因素的影响,如膜电位,神经毒素,钠钾-ATP酶、钙离子浓度、醛固酮以及磷酸化-脱磷酸化相关的蛋白酶等,其中最主要的是依赖于醛固酮激活的血清/糖皮质激素调节激酶-1(SGK1)的表达。SGK1激酶能活化某些钠、钾和氯化物通道,如上皮钠通道EnaC,肾外髓钾通道ROMK。SGK1通过多种方式激活ENaC,其中最主要的是磷酸化作用。SGK1激酶也能够磷酸化Nedd4-2,它是一个泛素化连接酶,能够泛素化EnaC,并从细胞膜移除ENaC的通道蛋白。磷酸化后的Nedd4-2与分子伴侣14-3-3相互作用进而减少Nedd4-2对ENaC的泛素化使得细胞膜表面ENaC通道蛋白富集。SGK1基因的三个不同的启动子以及不同剪切导致它有三种不同的转录产物,分别称作SGK1的不同亚型:ISO-1,ISO-2和ISO-3。SGK1通过磷酸化激活ENaC离不开SGK1的COOH端部分的激酶功能。虽然SGK1的三种亚型的N端通过不同的外显子编码,但它们享有共同的催化区和C端疏水基序,这意味着ISO-1,ISO-2和ISO-3都能在激活ENaC中起作用。ISO-2和ISO-3明显比ISO-1对ENaC的作用更大,其原因是ISO-1的-NH2端60个氨基酸序列使其不稳定,在泛素化作用下迅速降解,其编码的蛋白质半衰期特别短;而ISO-2和ISO-3与ISO-1的NH2端不同,ISO-2和ISO-3表达的蛋白质相对更稳定不太容易被泛素化。另外,SGK1的表达在几乎所有的组织中都能检测到,但是不同亚型在组织中表达具有特异性,在细胞内的定位也不同。SGK1定位于细胞核、质膜、内质网和细胞质等区域。ISO-1更倾向于在细胞核与质膜表达,ISO-2则定位于胞浆。适当的增加盐浓度可以增加SGK1的表达,但其机制并不清楚。Na+,K+是生物体内广泛存在的阳离子,在生物体内起着重要的作用;例如调节细胞内渗透压,调节体液的酸碱平衡,参与细胞内糖和蛋白质代谢,维持正常的神经兴奋和心肌运动等。阳离子对DNA结构影响的研究一直被关注,如Zn2+在DNA双螺旋的形成中有着重要的作用,Co2+和Ni2+能够与DNA双螺旋形成结合物。Na+,K+离子也和DNA结构的形成有关。1962年,Davies等人发现G4结构富含鸟嘌呤核酸。随后的研究表明,富含G的DNA序列能够形成G4聚体结构,单价阳离子能够结合到G4结构形成的平面中影响G序列形成。Na+,K+作为细胞中广泛存在的单价阳离子在G4结构的形成中有着重要的作用。白藜芦醇和黄连素结构类似,黄连素已确定能够和G4结构相互作用,我们预测白藜芦醇也可能和G4结构有关。我们发现SGK1基因含有能够形成G4结构的G4DNA序列,其中,在SGK1基因第二和第三个内含子区域各有一个可形成G4结构的序列,ISO-1的启动子区域含有三个可形成G4结构的序列。启动子区的G4结构能够阻止或促进基因的转录。本论文研究Na+,K+离子及白藜芦醇对SGK1基因中G4结构稳定性的影响。我们发现了 K+能使G4结构更稳定,并能抑制SGK1亚型ISO-2和ISO-3的表达;Na+通过松散G4结构而促进SGK1基因的三种亚型的表达;K+和白藜芦醇具有抵抗Na+的作用。方法:(1)采用半定量PCR(SEMI-PCR)方法研究Na+,K+对SGK1基因不同亚型表达的影响:首先制备SGK1基因不同亚型引物ISO-1,ISO-2,ISO-3分别用Na+,K+处理细胞后制备mRNA,然后反转录cDNA,以cDNA为模板,用SGK1基因三个不同亚型寡核苷酸序列为引物利用SEMI-PCR的方法分析Na+,K+对SGK1基因不同亚型表达的影响。(2)采用免疫组织化学的方法研究经Na+,K+处理后对细胞内SGK1基因蛋白表达定位的影响:不同浓度Na+,K+处理细胞后采用免疫组织化学的方法分析SGK1基因表达的定位。(3)采用圆二色谱、熔解曲线、PCR-Stop等方法研究SGK1基因G4DNA序列G4结构的形成、稳定性及其对转录过程的影响:首先制备了 SGK1基因的G4 DNA序列,分别用Na+,K+,白藜芦醇处理不同的G4DNA序列后利用圆二色谱法检测证明其能够形成G4结构。其次用Na+处理后加入K+或白藜芦醇,用K+处理后加入Na+或白藜芦醇利用圆二色谱检测对G4结构形成的影响。然后用紫外熔解曲线测定Na+,K+白藜芦醇处理后G4结构的Tm值分析Na+,K+及白藜芦醇对G4结构稳定性的影响。最后,用PCR-stop的方法研究了 G4结构形成对转录过程的影响。(4)采用荧光素酶报告基因系统研究Na+,K+对SGK1基因中G4结构的影响:首先构建不同G4序列的荧光素酶表达载体,转染细胞后分别用Na+,K+及白藜芦醇处理研究G4结构对转录起始的影响。结果:(1)Na+具有增加SGK1基因三个亚型的表达的作用,K+离子具有抑制了 SGK1基因亚型二表达的作用。(2)Na+能增加SGK1基因在胞浆的表达;K+能增加SGK1基因在细胞核的表达。(3)SGK1基因的G4 DNA序列在K+或Na+存在下都能够形成G4结构。在K+处理后的G4 DNA序列加入Na+后检测形成G4结构更松散;在Na+处理后的G4 DNA序列加入K+后检测形成G4结构更稳定;Na+处理后形成的G4结构的Tm值大多低于K+处理后形成的G4结构。在加入K+后G4结构的形成使PCR产物减少,在一定浓度范围内加入Na+后随着浓度的升高PCR产物增加明显,在含Na+的溶液中加入K+或白藜芦醇后产物明显减少。(4)Na+,K+对启动子区的G4结构有一定的响应;G4结构的形成对启动子的转录有不同的影响。结论:(1)Na+离子通过松散SGK1基因的G4结构促进SGK1基因的表达。(2)K+和白藜芦醇通过稳定G4DNA结构并具有对抗的Na+的作用。本论文提出了 Na+/K+可能通过G4 DNA结构对SGK1基因亚型的表达进行调控。阐明了 Na+,K+影响SGK1表达的分子机制,以及利用K+、白藜芦醇对抗Na+离子的作用机制。