论文部分内容阅读
葡萄糖是人体不可或缺的营养物质,是能量生产的主要来源。另一方面,葡萄糖可以作为营养物质或者信号分子来增强重要人类病原菌如金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等细菌的毒力。在2017年世界卫生组织发布的亟需新型抗感染药物的“重点病原体”清单中,铜绿假单胞菌被列为I类重点（极为重要）的级别。因此,研究铜绿假单胞菌感受、响应葡萄糖的机理可能有助于我们更好地设计合理的疗法来治疗该病原菌引起的感染。目前的研究表明,葡萄糖通过铜绿假单胞菌的外膜孔蛋白Opr B进入胞间质,胞间质的葡萄糖可以通过两条途径,即磷酸化途径和直接氧化途径进行后续的代谢。铜绿假单胞菌中复杂的葡萄糖代谢调节系统主要有五个:Hex R,Ptx S,Ptx R,Gnt R,GtrS-GltR。其中,调节子GltR与同源的激酶GtrS形成双组份信号转导系统。在铜绿假单胞菌PAO1中GltR对葡萄糖的转运活性是必需的,其可能激活编码Opr B孔蛋白和葡萄糖转运系统ABCGltBFGK的gltBFGK（gts ABCD）-opr B操纵子的转录。然而,这些结果与Daddaoua等人的发现有一定程度的矛盾。Daddaoua等人认为GltR是一个转录抑制子,抑制葡萄糖代谢相关基因的表达,而且磷酸化会减弱其与DNA的结合能力。虽然存在一些矛盾之处,但是以前的研究展示了GtrS-GltR双组份信号转导系统在铜绿假单胞菌等假单胞菌中对葡萄糖代谢发挥的重要作用。葡萄糖代谢的中间产物2-KG和6PG能够与激酶GtrS的配体结合域相互作用,从而增强GtrS的自动磷酸化和GltR的磷酸化水平。值得注意的是,激酶GtrS在铜绿假单胞菌与宿主的相互作用中扮演着重要的角色;在小鼠感染模型中铜绿假单胞菌的定殖和散播要依赖于GtrS。由此,我决定去研究铜绿假单胞菌中GtrS-GltR双组份信号转导系统的作用机制。在本研究论文中,我首先利用RNA-seq实验技术鉴定了铜绿假单胞菌的葡萄糖应答基因,实验结果显示野生型菌株PAO1中葡萄糖及其代谢中间产物转运和代谢相关基因均表达上调。qRT-PCR分析与RNA-seq实验结果类似,证明了RNA-seq实验结果是可信的。然后,我构建了缺失突变体菌株ΔgtrS-gltR、Δgcd、ΔgcdΔgtrS-gltR和互补菌株ΔgcdΔgtrS-gltR/p-gtrS-gltR、ΔgcdΔgtrS-gltR/p-gcd,以葡萄糖为唯一碳源监测了几个菌株的生长,结果发现只有ΔgcdΔgtrS-gltR菌株不能利用葡萄糖,表明双组份调节系统GtrS-GltR能够独立于Gcd调节葡萄糖的利用,反之亦然。通过融合的启动子分析,我发现在没有葡萄糖的情况下,gltB启动子活性很低并且没有受到gtrS-gltR基因缺失的影响。在有葡萄糖的情况下,gltB-lux的表达水平在野生型菌株PAO1中比没有葡萄糖时显著升高,表明葡萄糖能够诱导gltBFGK-opr B操纵子的表达。然而在突变体菌株ΔgtrS-gltR中,葡萄糖不能够提高gltB-lux的表达水平,其互补菌株ΔgtrS-gltR/p-gtrS-gltR中gltB-lux的表达水平能够恢复到野生型的水平,表明GtrS-GltR双组份信号转导系统能够正调控葡萄糖转运相关操纵子gltBFGK-opr B。通过报告基因技术和转座子诱变实验,我发现在体内葡萄糖激活GtrS-GltR双组份信号转导系统的过程不依赖于信号分子2-KG和6-PG,而是与编码周质葡萄糖结合蛋白的gltB基因有关。然后我通过ELISA、SPR、Co IP-MS和BACTH多个实验证明了GltB蛋白能够与激酶GtrS部分结合。此外,我还发现GltB蛋白能够与其它多个跨膜蛋白结合,提示了GltB蛋白可能影响铜绿假单胞菌更多的功能。为了验证铜绿假单胞菌GltB蛋白与葡萄糖结合在GtrS-GltR激活中的作用,我将五个保守结合位点W33,W34,K90,W268和D301进行了特异性的点突变,得到五个单突变质粒（W33A,W34A,K90A,W268A和D301A）。结果发现在有葡萄糖的情况下,五个点突变都会造成gltB-lux的表达水平下降,证明GtrS-GltR的激活依赖于GltB的葡萄糖结合位点。尤其重要的是,gltB突变体与gtrS突变体一样在果蝇感染模型和小鼠感染模型中毒力均显著降低。此外,CHIP-seq实验提供了GltR的潜在靶基因的基因组学数据,发现gltB是GltR主要的靶基因。总之,这些数据表明周质空间蛋白GltB和GtrS-GltR双组份信号转导系统形成了复杂的调控单元来调节铜绿假单胞菌响应葡萄糖时的毒力。