低氧是指生理性供氧量不足或者组织供氧量不足的状态。许多人类疾病的发生都与低氧相关，例如心脑血管疾病以及实体肿瘤。在这些疾病中，由于局部组织供血不足导致的低氧环境，使得处于该环境下的组织细胞中p53和BNIP3的表达量明显升高，并且进而导致大量的细胞凋亡，随着病情加剧和发病时间的延长，可能会导致组织的坏死，威胁病人的生命安全。　　 在低氧条件下，由于在转录水平上受到HIF-1上调，BH3-only家族基因BNIP3的蛋白水平也显著上升，通过BNIP3在线粒体膜上的定位的改变，线粒体膜通透性发生改变，而膜内外电位差的变化，会导致细胞色素c的释放，从而引起细胞凋亡。　　 同时，在低氧条件下，p53依赖于MDM2的泛素化降解途径减弱，使p53蛋白积累，并且主要以转录抑制因子的形式对下游基因进行调控。然而p53在低氧条件下对细胞凋亡的贡献仍然存在争议。　　 BNIP3的同源基因BNIP3L是首个被发现的受到p53转录激活的介导细胞凋亡的直接下游基因，并且在低氧条件下BNIP3L的高表达能够引起某些体外培养细胞的凋亡，这是首次观察到的低氧条件下p53直接调控细胞凋亡的现象。然而，在这一过程中关于p53与BNIP3之间关系的研究还没有过报道。　　 p53和BNIP3都能影响低氧诱导的细胞自吞噬作用。我们构建了LC3-GFP融合表达载体作为实验工具。LC3是细胞自吞噬体膜组成蛋白，转染细胞后，在激发光下可以显示绿色荧光，不发生自吞噬作用的细胞内，绿色荧光均匀分布，而发生自吞噬作用的细胞内，荧光蛋白在吞噬体膜上聚集，显示为绿色荧光斑点。　　 本课题对低氧条件下p53对BNIP3的调控机制进行了深入的研究，我们发现正常表达的野生型p53能够在低氧条件下有效抑制BNIP3的表达，并且对BNIP3介导的低氧诱导的细胞凋亡具有明显的抑制作用，同时这种抑制作用在斑马鱼体内也得到了验证，进一步的实验证实p53对BNIP3表达的抑制有助于斑马鱼在低氧条件下的存活。　　 主要内容包括：　　 1.利用启动子分析发现常氧条件和低氧条件下p53都能有效抑制BNIP3的启动子活性，并且这种抑制作用需要全长的p53蛋白以及p53完整的DNA结合结构域，这一结果提示p53对BNIP3的作用可能需要p53蛋白与BNIP3启动子的直接结合。　　 2.通过构建BNIP3启动子的不同突变体，我们发现p53通过BNIP3启动子上的p53应答元件对其表达进行抑制，利用染色体免疫沉淀实验我们发现，p53对BNIP3的抑制功能是通过招募转录抑制辅助因子mSin3A来实现的。　　 3.利用HCT-116细胞系进行的细胞凋亡实验进一步证实了低氧条件诱导的细胞凋亡是由BNIP3引起的，缺失了跨膜结构域的BNIP3蛋白能有效降低低氧条件下细胞凋亡的比例，并且p53对BNIP3的抑制作用对于维持低水平的细胞凋亡是必须的。　　 4.共转染自吞噬体膜蛋白LC3-GFP融合蛋白，在低氧条件下利用siRNA敲降p53的表达，能够观察到发生自吞噬作用的细胞比例明显增加，而共转染BNIP3的跨膜结构域缺失突变体，则可以将这一作用有效的挽救，说明BNIP3介导的自吞噬作用对其引起的细胞凋亡可能具有促进作用。　　 5.利用斑马鱼为体内实验模型进行研究。斑马鱼基因组中有3个BNIP3的同源基因：nip3a、bnip3和bnip3a。通过序列比对我们发现斑马鱼基因nip3a与人类BNIP3的同源性最高。利用原位杂交实验我们发现nip3a同样受到低氧条件的诱导，注射p53 MO可以使nip3a的表达量上升，而注射斑马鱼p53 mRNA则可以有效降低nip3a的表达。　　 6.低氧条件同样可以导致斑马鱼体内的细胞凋亡，并且凋亡细胞数量在p53突变型斑马鱼体内显著升高，通过注射nip3a跨膜缺失突变体的mRNA，可以有效挽救细胞凋亡的数量。　　 结合以上的研究，我们可以得到这样的结论：p53能直接抑制BNIP3的表并对低氧条件下BNIP3高表达介导的细胞凋亡起保护作用，在斑马鱼体内，表达的野生型p53能对低氧诱导的细胞凋亡起保护作用，并且有利于野生型鱼在低氧条件下的存活。