目的:脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）致残率高、预后差,其发病机理十分复杂,原发性损伤后可引起多个连续的级联反应,其中神经性炎症和神经元的铁死亡是主要的继发性损伤因素。高迁移率族蛋白盒1（high-mobility group protein box1,HMGB1）是一种损伤相关分子模式分子（damage-associated molecular pattern molecule,DAMP）。研究表明它在SCI后表达上调。HMGB1-p38/JNK信号通路在其他疾病中既可以参与调控炎症反应,也可以调控细胞铁死亡。但在SCI中尚未见相关报道。本研究拟通过体内外实验研究,验证HMGB1-p38/JNK信号通路在小胶质细胞激活后的炎症反应和神经元铁死亡中的作用,对SCI模型大鼠用HMGB1抑制剂甘草酸（glycyrrhizic acid,GA）进行了干预,观察抑制HMGB1后SCI大鼠损伤部位神经性炎症及铁死亡的改变。试图揭示HMGB1调控神经性炎症和铁死亡的双重作用这一机制,为HMGB1成为SCI的治疗靶点提供实验依据。方法:1.使用动脉瘤夹钳夹伤SD大鼠对应于T10水平段的脊髓来构建压迫型SCI实验动物模型。夹合力为70 g的德国蛇牌FT220T动脉瘤夹夹伤脊髓10秒,24只大鼠随机分成2组（sham组和SCI组）,每组12只,sham组大鼠只行椎板切除不做脊髓夹伤,SCI组大鼠接受脊髓夹伤手术。术后苏醒后开始行后肢运动功能Basso,Beattie,and Bresnahan Scale（BBB）评分,每天一次,持续3天后将大鼠深度麻醉后处死,取脊髓组织行HE染色和逆转录荧光定量聚合链式反应（reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR）分析HMGB1的表达。2.采用脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导HAPI小胶质细胞炎症反应来建立体外细胞模型（LPS-HAPI）。通过CCK-8实验摸索LPS的最佳干预浓度和时间,将LPS（100 ng/m L）处理HAPI小胶质细胞12小时后收集细胞行RT-q PCR实验。检测HMGB1 mRNA、小胶质细胞标志物离子钙结合适配器分子1（ionized calcium-binding adapter molecule 1,IBA1）mRNA及炎症因子肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白介素（interleukin,IL）-1β和-6的mRNA表达水平,成功构建HAPI小胶质细胞炎症反应体外细胞模型。随后,采用HMGB1抑制剂GA干预LPS诱导的HAPI细胞,分成LPS处理组和GA+LPS处理组。运用RT-q PCR实验和Western Blot（WB）实验检测HMGB1及炎症因子（TNF-a、IL-1β和IL-6）mRNA水平和蛋白水平的表达变化。构建HMGB1过表达质粒,转染GA处理的LPS-HAPI细胞,分成GA+LPS处理组、GA+LPS+NC（阴性对照）组和GA+LPS+HMGB1组,观察过表达HMGB1后能否逆转GA的抗炎效应。通过WB试验,对p38/JNK信号通路关键蛋白p38、p-p38、JNK和p-JNK的表达水平进行了检测。3.采用铁死亡诱导剂erastin诱导PC12细胞构建铁死亡体外细胞模型（erastin-PC12）。采用CCK-8实验摸索erastin药物的最佳干预浓度和时间,再用铁死亡抑制剂Fer-1处理,观察能否部分逆转erastin的铁死亡效应。WB实验检测铁死亡相关的关键蛋白酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（acyl-Co A synthetase long-chain family member 4,ACSL4）和谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4,GPX4）的表达,以及丙二醛（malonaldehyde,MDA）实验检测细胞的脂质过氧化水平和细胞铁含量测定检测细胞铁含量的变化。通过HMGB1抑制剂GA处理erastin诱导的PC12细胞,分成erastin处理组和GA+erastin处理组,采用RT-q PCR和WB实验检测HMGB1、ACSL4、GPX4的表达变化,以及MDA含量和细胞铁含量的变化。在此基础上,建立了HMGB1的高表达质粒,转染GA处理的erastin-PC12细胞,分成GA+erastin组、GA+erastin+NC（阴性对照）组和GA+erastin+HMGB1组,观察过表达HMGB1后能否逆转GA的抗铁死亡效应。通过WB试验,对p38/JNK信号通路关键蛋白的表达水平进行了检测。4.体内实验观察HMGB1抑制剂GA对压迫型SCI的影响。在体内动物实验中,采用动脉瘤夹钳夹伤对应于T10节段的脊髓。术后即刻予以GA（100 mg/kg）腹腔注射,每天一次,持续3天后处死SD大鼠,取损伤的脊髓组织进行后续的实验研究。总共90只SD大鼠,随机分成3组,分别为sham组、SCI组和SCI+GA处理组,每组30只,分别用于RT-q PCR实验、WB实验、MDA实验、组织铁含量测定实验和免疫组织染色实验,每个实验6只。采用HE染色观察SCI后组织损伤情况和炎症细胞浸润程度,RT-q PCR实验和WB实验检测HMGB1和炎症因子（TNF-a、IL-1β和IL-6）在mRNA水平和蛋白水平的表达变化。免疫组化检测HMGB1阳性细胞数变化,免疫荧光染色检测IBA1的表达变化。通过RT-qPCR、WB等实验方法,研究组织中与铁死亡密切相关的两个重要分子ACSL4、GPX4在mRNA水平及蛋白水平上的表达量。MDA实验和组织铁含量测定检测GA治疗后MDA含量和组织铁含量的变化。普鲁士蓝染色观察脊髓组织中的铁沉积,免疫荧光染色观察脊髓组织中的神经元标志蛋白Neu N的表达。结果:1.SCI形态学及HMGB1 mRNA在SCI组织中的表达水平:肉眼观察下,SCI组脊髓组织可见明显夹痕,组织受损,呈暗红色,SCI组大鼠后肢均为完全瘫痪,BBB评分为0分。HE染色发现,sham组脊髓组织形态完整,细胞分布均匀,细胞形态正常,无出血、水肿;而SCI组脊髓组织显示结构紊乱,破坏严重,灰质和白质分界不清,大量炎症细胞浸润,损伤部位广泛出血、肿胀。RTq PCR实验结果显示SCI后3天,HMGB1 mRNA在SCI组织中的表达水平显著升高,差异具有统计学意义。2.HMGB1-p38/JNK信号通路调控HAPI小胶质细胞的炎症反应。CCK-8实验结果显示,100 ng/m L LPS对HAPI细胞活力无影响,而500 ng/m L LPS在12小时后显著降低了HAPI细胞活力。RT-q PCR实验说明:LPS（100 ng/m L）作用12小时后,HMGB1在HAPI细胞中的表达增加,同时小胶质细胞标志物IBA1表达增加（P＜0.001）,炎症因子TNF-a、IL-1β、IL-6的表达增加。结果表明100ng/m L LPS可有效活化HAPI细胞并诱导其炎性反应。RT-q PCR及WB分析表明,100 m M的GA作用于HAPI细胞24小时后,HMGB1 mRNA基因及HMGB1蛋白的表达量均显著下降（P＜0.01）。与LPS组相比,GA预处理12小时后,LPSHAPI细胞HMGB1、IBA1及炎性因子（TNF-α、IL-1β及IL-6）mRNA的表达均显著下调。WB实验结果显示GA处理后HMGB1和炎症因子（TNF-a、IL-1β和IL-6）蛋白水平表达降低。因此,GA能通过降低HMGB1的表达来抑制HAPI小胶质细胞的炎症反应。通过转染HMGB1过表达质粒到GA与LPS共同处理的HAPI细胞后,RT-q PCR结果显示HMGB1过表达质粒转染后HMGB1表达升高（P＜0.001）。与对照组相比,转染HMGB1可显著上调IBA1及炎性因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）的mRNA表达（P＜0.001）。WB实验表明,在蛋白质的表达方面也出现了相似的改变。GA对p38及JNK的磷酸化有明显的抑制作用,而对p38及JNK的总蛋白表达没有明显的影响。这一结果提示GA的抗炎作用可能是通过HMGB1-p38/JNK信号通路介导的。3.HMGB1-p38/JNK信号通路调控PC12细胞的铁死亡。CCK-8实验显示在5μM浓度的erastin诱导24小时后,PC12细胞的活力下降了约50%。铁死亡抑制剂Fer-1（5μM）能部分逆转erastin的效应,显著提高PC12的细胞活力。Erastin处理24小时后,HMGB1和ACSL4蛋白表达升高,GPX4表达降低,MDA含量和铁含量增加,使用铁死亡抑制剂Fer-1后可以部分逆转erastin的这种效应。上述表明,erastin引起了PC12细胞的铁死亡。100 m M GA处理PC12细胞后,RT-q PCR和WB结果显示,与对照组相比,GA干预组HMGB1 mRNA和蛋白水平表达降低。RT-q PCR检测发现,与erastin组相比,GA+erastin组HMGB1、ACSL4的mRNA表达下降,GPX4的mRNA表达上升。WB实验得出GA+erastin组HMGB1、ACSL4的表达下调,而GPX4的表达则显著增加。另外,GA+erastin组MDA和铁的含量较erastin组显著降低。以上提示,GA可能是通过下调HMGB1,从而抑制erastin引起的PC12细胞铁死亡。随后将重组HMGB1过表达质粒转染到GA+erastin组的PC12细胞中。转染后,HMGB1 mRNA表达显著增加。RT-q PCR和WB结果显示,GA+erastin+HMGB1组ACSL4 mRNA和蛋白表达量升高,GPX4 mRNA和蛋白表达量降低。与GA+erastin组相比,MDA含量和细胞铁含量均有显著增加,体现在HMGB1过表达质粒组PC12细胞中。这些实验结果提示,HMGB1能逆转GA的抗铁死亡效应,高表达的HMGB1促进细胞的铁死亡。WB实验表明,GA对p38及JNK的磷酸化均有一定的抑制作用,而对p38及JNK的总体表达量无明显影响。这些结果表明,GA的抗铁死亡效应是通过HMGB1-p38/JNK信号通路介导的。4.HMGB1-p38/JNK信号通路调控SCI大鼠损伤脊髓局部的神经性炎症和铁死亡。HE染色显示SCI后3天脊髓组织破坏严重,大量炎症细胞浸润及出血,GA治疗组炎症细胞浸润减少。RT-q PCR、WB的实验发现,SCI后3天HMGB1、TNF-α、IL-1β及IL-6等炎性因子均显著升高,而GA治疗后,HMGB1及TNFa、IL-1β、IL-6的表达水平均显著下调。免疫组化分析证实GA处理后HMGB1表达降低。免疫荧光染色显示SCI后3天IBA1表达升高,GA治疗后IBA1表达降低,抑制了小胶质细胞的激活。RT-q PCR和WB实验结果显示,SCI组织中ACSL4 mRNA和蛋白水平表达升高,GPX4 mRNA和蛋白水平表达降低,GA治疗后逆转了这一效应。MDA及组织铁测定表明,SCI后3天,脊髓内MDA及组织铁的含量均明显增高,而GA治疗后可明显减少MDA及组织铁的含量。此外,普鲁士蓝和DAB染色显示SCI后3天损伤脊髓组织中铁沉积增加,GA治疗后SCI组织中铁沉积减少。免疫荧光染色显示,SCI后3天神经元标志物Neu N阳性表达降低,与SCI组相比GA治疗组脊髓中Neu N的阳性表达增加。GA对p38及JNK的磷酸化有明显的抑制作用,但对p38及JNK的整体表达无明显的影响。体内实验结果表明,GA通过抑制HMGB1-p38/JNK信号通路的激活可以缓解大鼠SCI后的神经性炎症和铁死亡。结论:（1）SCI后3天脊髓组织损伤严重,脊髓出现明显的出血、肿胀,局部大量炎症细胞浸润,HMGB1表达升高。（2）HMGB1-p38/JNK信号通路调控HAPI小胶质细胞的炎症反应。（3）HMGB1-p38/JNK信号通路调控PC12细胞的铁死亡。（4）HMGB1-p38/JNK信号通路调控SCI大鼠损伤脊髓局部的神经性炎症和铁死亡。