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背景:肝纤维化是肝脏对各种慢性损伤刺激的修复反应,持续进展的肝纤维化可导致肝硬化,甚至肝癌,严重威胁人类健康。肝纤维化发病机制复杂,目前尚未完全阐明,临床上仍缺乏有效的抗纤维化药物。肝星状细胞（Hepatic stellate cell,HSC）活化是肝纤维化发生的中心事件。Notch信号通路（尤其是Notch3信号通路）和NOX4信号通路与肝纤维化发生密切相关,但两者促进肝纤维化的具体机制仍有待进一步探究。新近研究发现Notch与NOX4信号通路在多种疾病中相互调控,考虑Notch3在肝纤维化发生中的重要作用,那么在肝纤维化发生过程中,Notch3和NOX4信号通路之间是否存在相互调控关系呢?目前尚不清楚。熊果酸（Ursolic acid,UA）是一种广泛存在于多种植物中的中药单体,具有独特的抗纤维化作用,但UA抗肝纤维化的具体作用机制仍有待进一步阐明。本课题组前期研究表明UA可通过下调NOX4信号通路抑制HSC活化和肝纤维化发生。已有研究表明在人结肠癌细胞中,UA能够抑制Notch信号通路激活。同时本课题预实验发现在HSC活化过程中,Notch信号通路可能作为上游调控NOX4。因此,我们推测UA可能通过调控Notch3/NOX4信号通路抑制HSC活化和肝纤维化发生。目的:1.明确在肝纤维化发生过程中Notch3和NOX4之间的具体调控关系;2.明确UA是否通过调控Notch3/NOX4信号通路抑制HSC活化和肝纤维化发生。方法:一、熊果酸对小鼠肝纤维化的影响1.实验分组及药物处理:将30只C57BL/6J小鼠随机均分为3组:空白对照组（Control组）、肝纤维化模型组（CCl4组）和UA治疗组（UA组）。Control组小鼠以1ml/kg剂量腹腔注射橄榄油,2次/周,共6周;CCl4组小鼠以1ml/kg剂量腹腔注射CCl4（橄榄油稀释成20%CCl4溶液）,2次/周,共6周;UA组小鼠以1ml/kg剂量腹腔注射CCl4,2次/周,共6周,其中后4周同时予50mg/kg UA灌胃治疗,1次/天。造模完成后获取眼球血清和肝脏标本,用于后续分子生物学实验和病理检测。2.肝脏HE、天狼星红、Masson染色和血清与肝脏羟脯氨酸（Hydroxyproline,HYP）含量检测,评估肝脏结构破坏和胶原沉积;检测血清转氨酶、白蛋白（Albumin,ALB）和总胆红素（Total bilirubin,TBil）,评估肝功能;q PCR检测肝脏TNF-α、IL-1β和F4/80 m RNA表达,评估肝脏炎症;检测肝脏丙二醛（Malondialdehyde,MDA）和总抗氧化能力（Total antioxidant capacity,T-AOC）,评估肝脏氧化应激;WB和q PCR检测肝纤维化相关基因和蛋白表达;免疫组化检测肝脏Col1α1和α-SMA表达。二、熊果酸对HSC活化的影响1.实验分组及药物处理:将对数生长期的人HSC株LX2种板后分为空白对照组（Control组）、TGF-β1刺激组（TGF-β1组）和UA干预组（UA组）。Control组细胞用含2%FBS的DMEM培养基培养48h;TGF-β1组细胞用含10ng/ml TGF-β1的DMEM培养基培养48h;UA组细胞先用含50μmol/L UA的DMEM培养基预处理30分钟,然后用含10ng/ml TGF-β1的DMEM培养基培养48h。2.WB和q PCR检测HSCα-SMA表达;MTT法检测HSC增殖;流式细胞仪检测HSC凋亡;Transwell检测HSC迁移;Transwell检测HSC侵袭;WB和q PCR检测HSC纤维化相关蛋白和基因表达。三、基于Notch3/NOX4信号通路探究熊果酸对HSC活化的影响1.UA对活化HSC Notch3、Hes1和NOX4表达的影响实验分组:将对数生长期的人HSC株LX2种板后分为Control组、TGF-β1组和UA组。根据实验分组,用TGF-β1或UA处理。2.沉默Notch3实验分组:将细胞转染Si-NC或Si-Notch3后分为Si-NC组、TGF-β1+Si-NC组、TGF-β1+Si-NC+UA组、TGF-β1+Si-Notch3组和TGF-β1+Si-Notch3+UA组。根据实验分组,用TGF-β1或TGF-β1+UA处理。3.沉默NOX4实验分组:将细胞转染Si-NC或Si-NOX4后分为Si-NC组、TGF-β1+Si-NC组、TGF-β1+Si-NC+UA组、TGF-β1+Si-NOX4组和TGF-β1+Si-NOX4+UA组。根据实验分组,用TGF-β1或TGF-β1+UA处理。4.WB和q PCR检测HSC Notch3、Hes1和NOX4表达;WB检测HSC纤维化相关蛋白表达;MTT法检测HSC增殖;流式细胞仪检测HSC凋亡;Transwell检测HSC迁移;Transwell检测HSC侵袭。四、基于Notch3/NOX4信号通路探究熊果酸对小鼠肝纤维化的影响1.UA对肝纤维化小鼠肝脏Notch3、Hes1和NOX4表达的影响实验分组:将小鼠随机分为Control组、CCl4组和UA组。根据实验分组,用橄榄油、CCl4进行造模,用UA进行干预治疗。造模完成后获取眼球血清和肝脏标本,用于后续分子生物学实验和病理检测。2.抑制Notch3的实验分组:将小鼠随机分为Control组、CCl4组、UA组、Notch3抑制剂（DAPT）治疗组（DAPT组）和Notch3抑制剂+UA联合治疗组（DAPT+UA组）。根据实验分组,用橄榄油、CCl4进行造模,用UA、DAPT或DAPT+UA进行干预治疗。造模完成后获取眼球血清和肝脏标本,用于后续分子生物学实验和病理检测。3.抑制NOX4的实验分组:将小鼠随机分为Control组、CCl4组、UA组、NOX4抑制剂（GKT137831）治疗组（GKT组）和NOX4抑制剂+UA联合治疗组（GKT+UA组）。根据实验分组,用橄榄油、CCl4进行造模,用UA、GKT或GKT+UA进行干预治疗。造模完成后获取眼球血清和肝脏标本,用于后续分子生物学实验和病理检测。4.肝脏HE、天狼星红、Masson染色和血清与肝脏羟脯氨酸（Hydroxyproline,HYP）含量检测,评估肝脏结构破坏和胶原沉积;检测血清转氨酶、ALB和TBil,评估肝功能;q PCR检测肝脏TNF-α、IL-1β和F4/80 m RNA表达,评估肝脏炎症;检测肝脏MDA和T-AOC,评估肝脏氧化应激;WB和q PCR检测肝脏Notch3、Hes1、NOX4、肝纤维化相关基因和蛋白表达;免疫组化检测肝脏Col1α1和α-SMA表达。结果:一、熊果酸对小鼠肝纤维化的影响1.肝纤维化小鼠模型建立与Control组小鼠相比,CCl4组小鼠肝脏HE染色、天狼星红和Masson染色结果提示肝小叶结构紊乱,肝内可见大量炎症细胞浸润、胶原沉积及瘢痕形成。CCl4组小鼠血清和肝脏羟脯氨酸含量较Control组小鼠明显增加（P＜0.05）。2.UA改善肝纤维化小鼠肝小叶结构破坏和胶原沉积与CCl4组小鼠相比,UA组小鼠肝脏HE染色、天狼星红和Masson染色结果提示肝小叶结构改善,肝内炎症细胞浸润、胶原沉积及瘢痕形成减少。UA组小鼠血清和肝脏羟脯氨酸含量较CCl4组小鼠明显减少（P＜0.05）。3.UA对肝纤维化小鼠肝功能的影响与CCl4组小鼠相比,UA组小鼠血清ALT、AST和TBil含量下降,血清ALB含量增加,差异均具有统计学意义。4.UA对肝纤维化小鼠肝脏炎症和氧化应激的影响与CCl4组小鼠相比,UA组小鼠肝脏TNF-α、IL-1β和F4/80 m RNA表达及MDA水平明显下降（P＜0.05）,但肝脏T-AOC无明显差异（P＞0.05）。5.UA对肝纤维化小鼠肝纤维化相关基因与蛋白表达的影响与CCl4组小鼠相比,UA组小鼠肝脏Col1α1、α-SMA和TIMP1蛋白与基因表达下降（P＜0.05）,但肝脏MMP1蛋白和基因表达升高（P＜0.05）。免疫组化结果提示UA组小鼠肝脏Col1α1和α-SMA表达较CCl4组小鼠明显减少（P＜0.05）。二、熊果酸对HSC活化的影响1.UA对HSC活化标志α-SMA表达的影响与TGF-β1组相比,UA组HSCα-SMA蛋白和基因表达明显下降（P＜0.05）。2.UA对HSC生物学行为的影响与TGF-β1组相比,UA组HSC增殖、迁移、侵袭能力明显下降,凋亡增加,差异均具有统计学意义。3.UA对HSC纤维化相关蛋白和基因表达的影响与TGF-β1组相比,UA组HSC Col1α1和TIMP1蛋白与基因表达下降（P＜0.05）,但HSC MMP1蛋白和基因表达升高（P＜0.05）。三、基于Notch3/NOX4信号通路探究熊果酸对HSC活化的影响1.UA对活化HSC Notch3、Hes1和NOX4表达的影响与TGF-β1组相比,UA组HSC Notch3、Hes1和NOX4蛋白与基因表达显著下降（P＜0.05）。2.沉默Notch3的小干扰RNA筛选与Si-NC组相比,WB和q PCR检测结果提示Si-Notch3-3沉默Notch3效果最佳,选用Si-Notch3-3进行后续沉默Notch3的实验。3.沉默NOX4的小干扰RNA筛选与Si-NC组相比,WB和q PCR检测结果提示Si-NOX4-1沉默NOX4效果最佳,选用Si-NOX4-1进行后续沉默NOX4的实验。4.沉默Notch3或NOX4探究HSC Notch3和NOX4信号通路的调控关系4.1沉默Notch3探究HSC Notch3和NOX4信号通路的调控关系TGF-β1+Si-NC组HSC Notch3、Hes1和NOX4蛋白表达较Si-NC组HSC显著增加（P＜0.05）,沉默Notch3后,TGF-β1+Si-Notch3组Notch3、Hes1和NOX4蛋白表达较TGF-β1+Si-NC组明显下降（P＜0.05）。与TGF-β1+Si-Notch3组相比,TGF-β1+Si-Notch3+UA组Notch3和NOX4蛋白表达无统计学差异（P＞0.05）。TGF-β1+Si-NC+UA组Notch3、Hes1和NOX4蛋白表达较TGF-β1+Si-NC组明显下降（P＜0.05）。4.2沉默NOX4探究HSC Notch3和NOX4信号通路的调控关系TGF-β1+Si-NC组HSC Notch3、Hes1和NOX4蛋白表达较Si-NC组HSC显著增加（P＜0.05）,沉默NOX4后,TGF-β1+Si-NOX4组NOX4蛋白表达较TGF-β1+Si-NC组明显下降（P＜0.05）,但Notch3和Hes1蛋白表达无明显差异（P＞0.05）。与TGF-β1+Si-NOX4组相比,TGF-β1+Si-NOX4+UA组NOX4蛋白表达无统计学差异（P＞0.05）,但Notch3和Hes1蛋白表达明显下降（P＜0.05）。TGF-β1+Si-NC+UA组Notch3、Hes1和NOX4蛋白表达较TGF-β1+Si-NC组明显下降（P＜0.05）。5.UA通过Notch3/NOX4信号通路抑制HSC活化5.1沉默Notch3对HSC活化的影响沉默Notch3后,TGF-β1+Si-Notch3组HSC Col1α1、α-SMA和TIMP1蛋白表达较TGF-β1+Si-NC组明显下降（P＜0.05）,MMP1蛋白表达显著上升（P＜0.05）。沉默Notch3后,同TGF-β1+Si-NC组相比,TGF-β1+Si-Notch3组HSC凋亡增加,迁移、侵袭和增殖能力下降,差异均有统计学意义。5.2沉默NOX4对HSC活化的影响沉默NOX4后,TGF-β1+Si-NOX4组HSC Col1α1、α-SMA和TIMP1蛋白表达较TGF-β1+Si-NC组明显降低（P＜0.05）,MMP1蛋白表达显著升高（P＜0.05）。沉默NOX4后,同TGF-β1+Si-NC组相比,TGF-β1+Si-NOX4组HSC凋亡增加,迁移、侵袭和增殖能力下降,差异均有统计学意义。5.3沉默Notch3或NOX4探究UA对HSC活化的影响与TGF-β1+Si-Notch3组相比,TGF-β1+Si-Notch3+UA组HSCα-SMA、TIMP1和MMP1蛋白表达无明显差异,TGF-β1+Si-Notch3+UA组HSC凋亡、迁移、侵袭和增殖亦无明显差异（P＞0.05）。同时,与TGF-β1+Si-NOX4组相比,TGF-β1+Si-NOX4+UA组HSC Col1α1、α-SMA、TIMP1和MMP1蛋白表达无明显差异,TGF-β1+Si-NOX4+UA组HSC迁移、侵袭和增殖亦无明显差异（P＞0.05）。TGF-β1+Si-NC+UA组HSC纤维化相关蛋白表达（Col1α1、α-SMA和TIMP1）、细胞迁移、侵袭和增殖能力较TGF-β1+Si-NC组明显下降（P＜0.05）,MMP1蛋白表达和细胞凋亡较TGF-β1+Si-NC组明显升高（P＜0.05）。四、基于Notch3/NOX4信号通路探究熊果酸对小鼠肝纤维化的影响1.UA对肝纤维化小鼠肝脏Notch3、Hes1和NOX4表达的影响与CCl4组小鼠相比,UA组小鼠肝脏Notch3、Hes1和NOX4蛋白与基因表达明显下降（P＜0.05）。2.抑制Notch3或NOX4探究肝脏Notch3和NOX4信号通路的调控关系2.1抑制Notch3探究肝脏Notch3和NOX4信号通路的调控关系CCl4组肝脏Notch3、Hes1和NOX4蛋白与基因表达较Control组显著增加（P＜0.05）,抑制Notch3后,DAPT组肝脏Notch3、Hes1和NOX4蛋白与基因表达较CCl4组明显下降（P＜0.05）。与DAPT组相比,DAPT+UA组肝脏Notch3、Hes1、NOX4蛋白与m RNA表达无统计学差异（P＞0.05）。UA组肝脏Notch3、Hes1和NOX4蛋白与m RNA表达较CCl4组明显下降（P＜0.05）。2.2抑制NOX4探究肝脏Notch3和NOX4信号通路的调控关系CCl4组肝脏Notch3、Hes1和NOX4蛋白与基因表达较Control组显著增加（P＜0.05）,抑制NOX4后,GKT组肝脏NOX4蛋白与基因表达较CCl4组明显下降（P＜0.05）,但Notch3和Hes1蛋白与基因表达无明显差异（P＞0.05）。与GKT组相比,GKT+UA组肝脏NOX4蛋白与m RNA表达无统计学差异（P＞0.05）,但Notch3和Hes1蛋白与m RNA表达明显下降（P＜0.05）。UA组肝脏Notch3、Hes1和NOX4蛋白与m RNA表达较CCl4组明显下降（P＜0.05）。3.UA通过Notch3/NOX4信号通路改善肝纤维化小鼠肝功能、肝脏炎症和氧化应激3.1抑制Notch3对肝纤维化小鼠肝功能、肝脏炎症和氧化应激的影响CCl4组小鼠血清ALT、AST和TBil含量较Control组小鼠显著增加（P＜0.05）,血清ALB含量显著减少（P＜0.05）,应用DAPT抑制Notch3后,DAPT组小鼠血清ALT、AST和TBil含量较CCl4组小鼠明显下降（P＜0.05）,血清ALB含量显著上升（P＜0.05）。CCl4组小鼠肝脏炎症（TNF-α、IL-1β和F4/80m RNA）和氧化应激（MDA含量）较Control组小鼠显著增加（P＜0.05）,抑制Notch3后,DAPT组小鼠肝脏炎症和氧化应激明显缓解（P＜0.05）。小鼠肝脏T-AOC在Control组、CCl4组和DAPT组无明显变化。3.2抑制NOX4对肝纤维化小鼠肝功能、肝脏炎症和氧化应激的影响与Control组小鼠相比,CCl4组小鼠血清ALT、AST和TBil含量显著增加（P＜0.05）,血清ALB含量显著减少（P＜0.05）,应用GKT137831抑制NOX4后,GKT组小鼠血清ALT、AST和TBil含量较CCl4组小鼠明显下降（P＜0.05）,血清ALB含量显著上升（P＜0.05）。CCl4组小鼠肝脏炎症（TNF-α、IL-1β和F4/80 m RNA）和氧化应激（MDA含量）较Control组小鼠显著增加（P＜0.05）,抑制NOX4后,GKT组小鼠肝脏炎症和氧化应激明显缓解（P＜0.05）。小鼠肝脏T-AOC在Control组、CCl4组和GKT组无明显变化。3.3抑制Notch3或NOX4探究UA对肝纤维化小鼠肝功能、肝脏炎症和氧化应激的影响与DAPT组小鼠相比,DAPT+UA组小鼠血清ALT、AST、TBil和ALB含量无明显差异（P＞0.05）。DAPT+UA组小鼠肝脏炎症（TNF-α、IL-1β和F4/80m RNA）和氧化应激（MDA含量）与DAPT组小鼠相比亦无明显差异（P＞0.05）。同时,GKT+UA组小鼠血清ALT、AST、TBil和ALB含量较GKT组小鼠无明显差异（P＞0.05）。GKT+UA组小鼠肝脏炎症和氧化应激与GKT组小鼠相比亦无明显差异（P＞0.05）。CCl4组小鼠血清转氨酶与胆红素、肝脏炎症和氧化应激较Control组小鼠显著增加（P＜0.05）,血清ALB含量较Control组小鼠显著减少（P＜0.05）,予UA干预处理后,UA组小鼠血清转氨酶与胆红素、肝脏炎症和氧化应激明显下降,血清ALB含量明显增加（P＜0.05）。4 UA通过Notch3/NOX4信号通路改善小鼠肝纤维化4.1抑制Notch3对小鼠肝纤维化的影响与CCl4组小鼠相比,DAPT组小鼠肝脏HE染色、天狼星红染色、Masson染色、Col1α1和α-SMA免疫组化结果提示肝小叶结构改善,肝脏胶原沉积和纤维间隔形成减少（P＜0.05）。与CCl4组小鼠相比,DAPT组小鼠血清和肝脏羟脯氨酸含量、肝脏Col1α1、α-SMA和TIMP1蛋白与基因表达减少（P＜0.05）,MMP1蛋白与基因表达升高（P＜0.05）。4.2抑制NOX4对小鼠肝纤维化的影响与CCl4组小鼠相比,GKT组小鼠肝脏HE染色、天狼星红染色、Masson染色、Col1α1和α-SMA免疫组化结果提示肝小叶结构改善,肝脏胶原沉积和纤维间隔形成减少（P＜0.05）。与CCl4组小鼠相比,GKT组小鼠血清和肝脏羟脯氨酸含量、肝脏Col1α1、α-SMA和TIMP1蛋白与基因表达减少（P＜0.05）,MMP1蛋白与基因表达升高（P＜0.05）。4.3抑制Notch3或NOX4探究UA对小鼠肝纤维化的影响与DAPT组小鼠相比,DAPT+UA组小鼠肝小叶结构、肝脏胶原沉积与纤维化间隔形成、血清和肝脏羟脯氨酸含量无明显差异（P＞0.05）。DAPT+UA组小鼠肝纤维化相关蛋白和基因表达与DAPT组小鼠相比亦无明显差异（P＞0.05）。同时,GKT+UA组小鼠肝小叶结构、肝脏胶原沉积与纤维化间隔形成、血清和肝脏羟脯氨酸含量较GKT组小鼠无明显差异（P＞0.05）。GKT+UA组小鼠肝纤维化相关蛋白和基因表达与GKT组小鼠相比无明显差异（P＞0.05）。与Control组小鼠相比,CCl4组小鼠肝小叶结构明显紊乱,大量肝脏胶原沉积与纤维化间隔形成,血清和肝脏羟脯氨酸含量明显升高,肝脏Col1α1、α-SMA和TIMP1蛋白与基因表达明显升高,MMP1蛋白与基因表达明显下降,差异均有统计学意义,予UA干预治疗后,UA组小鼠上述指标明显改善。结论:1.在肝纤维化发生过程中,Notch3作为上游调控NOX4,Notch3/NOX4信号通路是肝纤维化的发病机制之一;2.UA可通过调控Notch3/NOX4信号通路抑制HSC活化和肝纤维化发生。