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背景和目的:脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）,尤其创伤性脊髓损伤（traumatic SCI,TSCI）,是一种灾难性的中枢神经系统疾病,具有较高的发病率和死亡率。TSCI可以引起不同程度的感觉和运动功能障碍,严重影响患者的生活质量,增加患者家庭和社会的经济负担。目前,临床上对于有手术指征的急性TSCI患者主要都是通过早期手术减压和重塑脊柱结构的稳定性防止进一步的压迫型损伤,尚无有效证据表明药物治疗能助力TSCI患者长期获益。损伤常引起神经细胞死亡和功能退化,包括内出血,水肿和急、慢性炎症反应。目前的研究表明,凋亡、坏死、自噬和焦亡在TSCI的进展中发挥重要作用。铁死亡是一种新型的非坏死性调节性细胞死亡形式,目前的研究表明铁死亡参与了损伤脊髓局部糟糕的微环境,加重了组织损伤的严重程度,抑制神经元铁死亡可以促进TSCI后神经功能的恢复。二甲双胍（Metformin,Met）是临床上常用的一种治疗2型糖尿病的经典药物,据报道可以有效促进TSCI实验动物感觉和运动功能的恢复,最近因其在病理条件下的抗铁死亡作用而引起了人们的兴趣。过表达的血红素加氧酶1（heme oxygenase 1,HMOX1/HO-1）已在不同的中枢神经系统损伤模型中被报道,并通过抗炎和调节细胞氧化还原稳态发挥神经保护作用。最近,因其能够通过催化血红素降解为胆绿素,一氧化碳和铁造成铁的蓄积从而驱动细胞内铁死亡进程再次引发争议。本研究旨在探讨Met能否通过调控铁死亡在TSCI大鼠中发挥神经保护作用,同时阐明HMOX1在SCI后神经细胞铁死亡中的作用及其对Met发挥神经保护作用的潜在影响。方法:（1）SCI实验动物模型的构建以及铁死亡特征的鉴定。使用吸入式气体麻醉法麻醉实验动物,使用动脉瘤夹压迫型损伤法制备大鼠SCI模型。通过苏木精-伊红（hematoxylin-eosin,HE）染色法初步判断压迫型损伤模型损伤中心区域的损伤程度,通过3,3-二氨基联苯胺（3,3,-diaminobenzidine,DAB）加强法普鲁士蓝染色技术评估SCI后第1天、第3天、第7天和第14天损伤中心区域铁沉积的情况,通过Fluoro-Jade B（FJB）染色法观察损伤后各时间点变性神经元的比例,通过蛋白免疫印迹（western blotting,WB）检测损伤后各时间点4羟基壬烯醛（4-Hydroxynonenal,4HNE）,脂酰Co A合成酶4（acyl-Co A synthetase long-chain family member 4,ACSL4）和谷胱甘肽过氧化酶4（glutathione peroxidase 4,GPX4）的相对蛋白水平,通过透射电镜（transmission electron microscopy,TEM）观察损伤后第1天和第3天线粒体的超微结构。（2）二甲双胍在SCI神经细胞铁死亡中的作用研究。采用Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）运动功能评分评估各组在损伤后35天内的运功功能变化情况,通过损伤后第35天的脚印评估各组运动功能的恢复情况。采用实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）检测各组在损伤后第1天和第3天Gpx4和Acsl4 m RNA的相对水平,采用WB检测各组4HNE和ACSL4的相对蛋白表达。采用WB检测各组在损伤后第3天白细胞介素1β（interleukin-1 beta,IL-1β）和白细胞介素6（interleukin 6,IL-6）的相对蛋白水平,采用荧光双标法评估各组在损伤后第3天GPX4、ACSL4、IL-1β和IL-6阳性神经元的相对比例。（3）HMOX1在SCI及二甲双胍干预后的表达情况。通过生物信息学方法分析和动物实验验证HMOX1在损伤脊髓中的相对表达情况,同时了解SCI后第1天、第3天、第7天、第14天和第56天炎症因子和铁死亡相关基因的动态变化趋势。通过免疫组化（immunohistochemistry,IHC）和WB验证各时间点各组脊髓中HMOX1的相对蛋白表达情况。通过qRT-PCR和WB检测各组在损伤后第1天和第3天HMOX1的整体表达水平。（4）慢病毒介导的HMOX1下调对二甲双胍干预的影响。通过体外转染细胞初步筛选HMOX1的有效干扰序列,使用荧光检测,qRT-PCR和WB验证三种慢病毒干扰序列的有效性。通过局部多点注射10u L慢病毒在体内感染T9节段脊髓以进一步筛选HMOX1的有效干扰序列,使用冰冻切片荧光检测和WB验证慢病毒载体干扰序列的有效性。使用WB检测各组在损伤后第3天HMOX1、4HNE、ACSL4和GPX4的相对蛋白表达水平。使用荧光双标法评估各组在损伤后第3天Iba1+/i NOS+和Iba1+/Arg1+双标记小胶质细胞/巨噬细胞的比例。结果:（1）SCI实验动物模型的构建以及铁死亡特征的鉴定。动脉瘤夹压迫型损伤大鼠模型是一种相对稳定且可靠的SCI实验动物模型。在本研究中,显著的铁沉积出现在损伤后第7天和第14天,显著的神经元退变出现在损伤后第1天和第3天。铁死亡标志物4HNE和ACSL4在损伤后第1天和第3天显著升高,GPX4在损伤后各时间点一直处于显著降低的水平。我们能观察到损伤的线粒体超微结构,但是未发现具备铁死亡形态特征的线粒体。（2）二甲双胍在SCI神经细胞铁死亡中的作用研究。200mg/kg Met腹腔注射14天显著改善了SCI大鼠后肢运动功能的恢复。Met治疗显著降低了4HNE、ACSL4、IL-1β和IL-6的相对表达,同时显著促进GPX4的相对表达。Met治疗显著降低了ACSL4,IL-1β和IL-6阳性神经元的相对比例,同时显著提高了GPX4阳性神经元的相对比例。（3）HMOX1在SCI及二甲双胍干预后的表达情况。生物信息学分析结果显示铁死亡相关基因Hmox1在大鼠和小鼠的多种SCI模型中均显著升高,检测的时间点包括损伤后第9小时、第1天、第3天、第7天、第9天、第14天、第35天和第56天。其次,SCI后炎症因子和铁死亡相关基因的动态变化结果揭示了损伤后多种铁死亡关键因子的变化趋势,同时表明损伤第3天是一个值得关注的时间点。最后,我们的实验结果显示HMOX1在损伤脊髓的灰质和白质以及整个损伤中心区域中都是显著升高的,并且Met治疗进一步升高了HMOX1的整体水平。（4）慢病毒介导的HMOX1下调对二甲双胍干预的影响。我们利用两种大鼠来源的细胞系在体外转染实验中通过荧光、qRT-PCR和WB实验进行有效性验证筛选出了一个干扰效果最佳的慢病毒序列。随后将该序列慢病毒载体注射到大鼠目标节段脊髓中充分感染14天,荧光检测和WB实验进一步证实了该序列体内干扰的有效性。在本研究中,慢病毒介导的HMOX1表达下调是稳定且持久的,SCI和Met治疗均不能有效逆转这一效应。此外,HMOX1的下调促进了损伤后4HNE和ACSL4的进一步升高,以及GPX4的进一步下调,表明HMOX1的下调促进了损伤脊髓中的神经细胞铁死亡。HMOX1敲低后Met治疗仍然能有效降低4HNE的水平,但是不能降低ACSL4和升高GPX4的表达水平,表明Met抗铁死亡作用的实现部分依赖于高水平的HMOX1。最后,HMOX1的下调增加了损伤后Iba1+/i NOS+小胶质细胞/巨噬细胞的比例,降低了Iba1+/Arg1+小胶质细胞/巨噬细胞的比例,表明HMOX1的下调促进了M1型小胶质细胞/巨噬细胞的极化。HMOX1敲低后Met治疗仍然能有效降低Iba1+/i NOS+小胶质细胞/巨噬细胞的比例,同时升高Iba1+/Arg1+小胶质细胞/巨噬细胞的比例,表明Met能以不依赖于高水平HMOX1的方式促进M1型小胶质细胞/巨噬细胞向M2型极化。结论:综上所述,本研究结果提示Met具有抑制SCI后神经细胞铁死亡的作用,该作用的实现部分依赖于过表达的HMOX1。Met发挥抗炎作用并可以通过其他不依赖于高水平HMOX1的途径减轻SCI后的进一步损伤。此外,HMOX1可以通过抗炎、减轻氧化应激和抑制铁死亡等作用发挥神经保护作用。因此,HMOX1是SCI后神经细胞铁死亡的有效干预靶点,HMOX1受Met调控并影响其在SCI中的抗铁死亡作用。