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目的:近年来糖尿病继发性并发症已成为全球公共卫生问题,外周动脉疾病(Peripheral arterial disease,PAD)是2型糖尿病常见的并发症。目前,PAD的治疗方式主要为介入治疗、药物治疗、基因治疗及手术治疗等,然而这些治疗方式应用局限,因此亟待寻求更便捷有效的治疗方式。越来越多的研究表明,间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是干细胞家族的主要成员,具有多项分化能力和免疫调节作用。移植脂肪源间充质干细胞(Adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)能够促进血管的修复和再生,是一种很有前景的PAD治疗方法。然而,ADSCs体外扩增效率低、移植后体内维持时间短等关键性问题,仍是目前干细胞临床应用的关键障碍。因此,我们应用不同波长的光,在体外激活ADSCs,提高ADSCs的治疗效果。综上所述,我们提出假设:光动力可能通过促进ADSCs的旁分泌及内皮化功能,介导血管新生,提高糖尿病下肢缺血血流灌注。本课题旨在探究应用光动力能否增强ADSCs对高脂饮食小鼠下肢缺血的治疗,从而促进缺血组织血管形成及改善葡萄糖代谢。方法:1.小鼠喂养:使用高脂高糖饲料喂养雄性C57BL/6J小鼠14周。2.ADSCs提取:取小鼠两侧皮下脂肪,剪碎成糊状,用新鲜配置的胶原酶溶液在37℃恒温摇床消化40分钟,370g离心10分钟,弃上清液,将细胞沉淀重悬于ADSCs生长培养基,置于37℃,5%CO2的培养箱中培养。3.ADSCs激活:收集ADSCs,重悬在5mL生长培养基中,转移至特制的注射器,封好,置于细胞治疗转化仪光照处理30min。该细胞治疗转化仪集成了575-595nm(5-20mW),630-635nm或660-670nm(10-100mW)和510-540nm(10-60mW)这三种不同波长的单色光。4.ADSCs鉴定:收集P3代细胞,流式细胞术检测CD29、CD90、CD105的表达。5.细胞增殖实验:将激活的ADSCs继续培养,观察第1、3、5、7天细胞增殖情况。6.下肢缺血模型的建立:腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉小鼠后,将其下肢毛发脱去,沿小鼠左下肢正中的皮肤纵行切开,在腹股沟处分离出股动脉,近端结扎并剪断股动脉,从而建成小鼠左下肢缺血模型,并记录术前术后体重。7.ADSCs移植:下肢缺血模型建立次日,以尾静脉注射的方式移植50万ADSCs到小鼠体内。由此,建立光激活的Lighted-ADSCs组、未激活的Normal-ADSCs组和对照组。8.激光多普勒成像:在下肢缺血术前及术后第3、7、14、21、28、38天使用高分辨率激光多普勒成像仪扫描各小鼠双侧下肢,使用缺血/非缺血下肢的血流灌注比用作灌注后血流恢复的指标。9.免疫荧光检测:将小鼠缺血侧肌肉制成病理石蜡切片,通过免疫荧光染色,检测α平滑肌肌动蛋白(α-actin)、血小板内皮黏附分子(PECAM-1,又称CD31)的表达,观察缺血诱导的新生血管形成。10.实时荧光定量PCR检测:取小鼠缺血侧内收肌,提取总RNA,检测肌肉中血管生成相关因子和炎症因子的表达,分析3组之间的血管生成相关因子和炎症因子的表达是否具有差异,进一步分析其血管生成能力的差异。11.葡萄糖耐量试验(Glucose tolerance test,GTT)和胰岛素耐受试验(Insulin tolerance test,ITT):分别于术后第22天和第25天对小鼠禁食12小时、6小时,按照2g/Kg的剂量腹腔注射葡萄糖溶液、0.75IU/Kg的剂量腹腔注射胰岛素溶液,分别于0分钟、30分钟、60分钟、90分钟、120分钟通过尾静脉取血的方式测定血糖值。12.ADSCs内皮化检测:将光激活的Lighted-ADSCs、未激活的Normal-ADSCs继续培养,流式细胞术检测激活后第3、7、14天CD31、CD34的表达。13.蛋白组学分析:采用高效液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)测定人脂肪源间充质干细胞(Human adipose-derived mesenchymal stem cells,hADSCs)的条件培养基(Conditional medium,CM)中的蛋白质强度。结果:1.ADSCs高表达间充质干细胞标志物CD29、CD90、CD105,符合间充质干细胞特性。2.光动力促进ADSCs增殖。3.移植ADSCs不影响高脂饮食小鼠体重、血脂水平。4.多普勒血流扫描和免疫荧光染色显示Lighted-ADSCs促进高脂饮食小鼠缺血下肢的血流灌注恢复,延长ADSCs的促血管灌流作用。5.实时荧光定量PCR显示Lighted-ADSCs增加了血管内皮生长因子A(Vascular endothelial growth factor A,VEGF-A)、血管内皮生长因子C(Vascular endothelial growth factor C,VEGF-C)、血小板衍生生长因子(Platelet-derived growth factor B,PDGF-B)、血管生成素样蛋白4(Angiopoietin like protein-4,ANGPTL4)的表达。6.实时荧光定量PCR显示Lighted-ADSCs减少缺血侧肌肉中巨噬细胞M1型炎症因子的表达,增加M2型炎症因子的表达,促进缺血侧肌肉巨噬细胞的极性转化。7.移植不同处理方式的ADSCs均能改善高脂饮食诱导的葡萄糖、胰岛素代谢异常,提高葡萄糖耐量、增强胰岛素敏感性。8.光动力增加了ADSCs中CD31、CD34的表达,促使ADSCs源的内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells,EPCs)增多。9.光动力显著上调hADSCs分泌的血管生成相关蛋白。结论:1.光动力促进ADSCs增殖,同时可以促进ADSCs向内皮祖细胞分化。2.光动力增强ADSCs对下肢缺血的治疗效果,改善血流灌注,促进血管新生。3.ADSCs移植改善高脂饮食小鼠的代谢微环境,提高葡萄糖耐量和胰岛素敏感性。4.光动力显著上调hADSCs分泌的血管生成相关蛋白。5.光动力能有效提高在ADSCs治疗下肢缺血中的作用,有利于ADSCs的临床应用。