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头颈部鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC）是世界上最常见的上皮源性的恶性肿瘤之一（Chi AC et al.,2015）。80%-90%的HNSCC癌症相关死因是癌症的远处转移和局部复发,而上皮间充质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）被认为在癌症转移过程中发挥了重要的作用。最新研究发现,在HNSCC中癌症侵袭的前缘肿瘤细胞并没有完全获得间质细胞的特性,同时保留了部分上皮组织的特点,这个特征被认为是一种不完全上皮间充质转化（partial EMT,P-EMT）。已经有许多lncRNA被发现在调控EMT程序中扮演了重要角色,但是P-EMT这一程序相关的长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）尚未见研究报道。因此,本项研究将基于P-EMT程序的关键转录因子SLUG寻找与P-EMT程序相关的lncRNA,期待能够为进一步阐明P-EMT的分子机制及提出靶向策略提供更多的证据和思路。第一部分 头颈鳞癌中不完全上皮间充质转化相关长链非编码RNA的筛选目的:通过生物信息学手段鉴定出与HNSCC中P-EMT程序相关的lncRNA分子,并预测其生物学功能和临床价值。方法:从癌症基因组图谱（TCGA,The Cancer Genome Atlas）和基因表达汇编（Gene Expression Omnibus,GEO）数据库下载亚洲HNSCC测序数据及临床信息数据,采取R语言筛选差异表达基因和非编码RNA。基于TCGA数据库得到的HNSCC基因表达矩阵,筛选出与SLUG基因皮尔森相关系数的绝对值大于0.4的lncRNA。将从TCGA和GEO数据库得出的差异lncRNA与SLUG相关的lncRNA取交集,然后对重叠的lncRNA分子在HNSCC患者中表达进行生存分析。对长链非编码 RNA MYOSLID（myocardin-induced smooth muscle lncRNA,inducer of differentiation）相关的mRNA进行京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）信号通路富集分析和基因本体论（Gene Ontology,GO）功能注释。基于从TCGA数据库下载的临床信息数据分析MYOSLID表达与临床病理参数之间的关系。结果:我们从TCGA数据库中筛选出了 9128个差异表达的lncRNA和mRNA,从GEO数据库中筛选出了 819个差异lncRNA和mRNA,还鉴定出了 54个与SLUG相关的lncRNA。交集得到了 9个重叠的lncRNA之中只有MYOSLID与HNSCC患者的生存预后相关。KEGG信号通路富集分析和GO功能注释发现MYOSLID具有强大生物学功能,与MYOSLID相关的基因主要集中在负责调控细胞侵袭转移的信号通路和功能表型。基于TCGA数据库下载的临床信息数据的单因素和多因素分析结果表明,MYOSLID表达异常与HNSCC的TNM分期及较晚的临床分期相关,MYOSLID可作为一个独立预后因素。结论:MYOSLID是一个与HNSCC的P-EMT程序密切相关并且具有重要的潜在生物学功能的关键lncRNA。第二部分 长链非编码RNAMYOSLID在人头颈鳞癌中表达及其临床价值目的:在人HNSCC组织样本和细胞系中验证MYOSLID的表达,并探索临床价值及其与P-EMT相关的关键分子的相关性。方法:MYOSLID在HNSCC组织及配对的黏膜组织中的表达水平用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）的方法进行检测。用原位杂交（in site hybridization,ISH）的方法检测MYOSLID在我们构建的HNSCC组织芯片中的表达情况。用单因素和多因素分析MYOSLID表达与HNSCC患者临床病理参数之间的关系及预后意义。通过免疫组化（IHC-P）检测SLUG、PDPN、LAMB3的表达情况,并使用皮尔森相关性分析统计分析MYOLID的表达与SLUG、PDPN、LAMB3的相关性。结果:MYOSLID在癌组织中表达水平显著升高。在Cal27,SCC4,SCC9及TCA8113四种细胞系中,MYOSLID在Cal27细胞系中表达水平最高。ISH结果发现MYOSLID的表达在癌组织浸润前缘显著升高,MYOSLID高表达表达与HNSCC患者TNM分期及较晚的临床分期相关。MYOSLID可作为一个独立的预后判断因素。MYOSLID表达与SLUG、PDPN、LAMB3的表达显著相关。结论:MYOSLID在人HNSCC中高表达可作为一个预测转移风险较高的生物学标志物。MYOSLID在人HNSCC中高表达与P-EMT程序密切相关。第三部分 人头颈鳞癌中长链非编码RNA MYOSLID的生物学功能及促进癌症转移的机制研究目的:研究MYOSLID对人HNSCC细胞侵袭迁徙生物学行为和远处器官转移能力的影响并探索潜在的分子机制。方法:在Cal27、SCC4、SCC9和TCA8113细胞系中评估P-EMT的存在情况并挑选出最接近P-EMT状态的HNSCC细胞系用于进一步研究。Cal27和SCC4细胞系用siRNA沉默MYOSLID后通过划痕实验和Transwell实验观察HNSCC细胞侵袭迁徙行为的变化。Western印迹法检测上皮标志物E-cadherin,间质标志Vimentin蛋白和P-EMT标志物SLUG、PDPN、LAMB3表达水平改变情况。选择敲除效率最好的一条siRNA MYOSLID-homo-323序列设计慢病毒shRNA-MYOSLID。shRNA-MYOSLID 慢病毒转染 HNSCC 细胞系 Cal27 构建MYOSLID稳定敲除的细胞系。将MYOSLID稳定敲除Cal27细胞和对照组细胞通过尾静脉注射进入裸鼠体内,观测统计肝肺器官转移结节数目。应用PI3K信号激动剂740 Y-P处理Cal27和SCC4细胞系,检测MYOSLID的表达变化。结果:沉默MYOSLID之后,HNSCC细胞侵袭迁徙能力显著降低,SLUG、PDPN和LAMB3的表达水平显著降低,而E-cadherin和Vimentin表达水平没有明显改变。成功构建了 MYOSLID稳定敲除的Cal27细胞系。裸鼠的肝肺组织切片苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining,HE）染色结果显示,shRNA-MYOSLID组的肿瘤转移灶数目明显少于shRNA-NC组。应用PI3K信号通路激动剂740 Y-P处理Cal27和SCC4细胞之后,MYOSLID的表达水平显著升高。结论:MYOSLID通过调控P-EMT程序影响人HNSCC细胞的远处转移。MYOSLID的表达升高可能与PI3K信号通路的异常激活相关。