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目的应用同位素标记的相对和绝对定量(isobaric tag for relative and absolute quantification,i TRAQ)标记的二维液相色谱串联质谱(two-dimensional liquid chromatography-tandem mass spectrometry,2DLC-MS/MS)联合生物信息分析软件(Ingenuity Pathways Analysis,IPA)比较儿童急性T淋巴细胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia,T-ALL)与急性B淋巴细胞白血病(B-cell acute lymphoblastic leukemia,B-ALL)血清差异表达蛋白,筛选ALL分型诊断标记物、T-ALL治疗的新靶点及探讨T-ALL可能的发病机制。方法1.收集儿童初治B-ALL与T-ALL血清各20例,分别等量混合每组血清标本,提取蛋白后应用多重亲和去除系统(Multiple Affinity Removel System,MARS)去除血清中14种高丰度蛋白,超滤除盐后采用Bradford法测定总蛋白浓度,并进行SDS-PAGE电泳,检测蛋白样品的质量。2.应用i TRAQ试剂标记经胰酶消化后的肽段,114标记B-ALL组,115标记T-ALL组。将标记后的肽段混合,运用二维高效反相液相色谱进行分离,然后串联质谱对样品进行分析鉴定。3.根据所鉴定出蛋白质的iTRAQ相对定量值,通过对T-ALL组与B-ALL组的蛋白表达量进行比较,与B-ALL相比较,筛选出T-ALL中上调或下调1.2倍以上的差异蛋白。4.应用生物信息学软件IPA分析T-ALL与B-ALL相比较的差异表达蛋白,获得差异表达蛋白的生物功能以及参与的信号通路和蛋白相互作用网络;并根据IPA分析结果初步筛选出有意义的血清差异表达蛋白并探讨其意义。5.采用ELISA双抗夹心法分别检测了30例B-ALL、30例T-ALL的血清可溶性L-选择素(s L-selectin)表达水平,并计算其统计学意义来验证质谱的准确性。结果1.采用i TRAQ标记结合2DLC-MS/MS技术对T-ALL与B-ALL进行比较蛋白质组学研究,筛查T-ALL与B-ALL的血清差异蛋白。质谱共鉴定出有定量信息的非冗余蛋白468个,与B-ALL相比,计算T-ALL组蛋白表达值与B-ALL组比值,设定其比值>1.2或<0.8(即差异倍数>1.2且P<0.05)为明显上调或下调蛋白,即有意义的差异表达蛋白。T-ALL组血清差异蛋白共有38个,其中显著上调蛋白质31个,下调蛋白质7个。2.将在i TRAQ定量蛋白质组学分析中得到的差异显著的蛋白质上传http://www.ingenuity.com进行IPA软件在线分析,经分析显示这些血清差异蛋白主要分布在与心血管疾病(Cardiovascular Disease)、脂质代谢(Lipid Metabolism)、分子转运(Molecular Transport)、小分子生物化学(Small Molecular Biochemistry)、蛋白合成(Protein Synthesis)、细胞运动(Cellular Movement)、血液系统的发育和功能(Hematological System Development and Function)、免疫细胞运输(Immune Cell Trafficking)、炎症反应(Inflammatory Response)等相关的功能中;3.血清差异蛋白参与的富集度较高的生物通路涉及肝X受体/类视黄醇X受体激活(LXR/RXR Activation)、动脉粥样硬化信号(Atherosclerosis Signaling)、巨噬细胞中白介素12信号与产生(IL-12 Signaling and Production in Macrophages)、巨噬细胞中一氧化氮和活性氧的产生(Production of Nitric Oxide and Reactive Oxygen Species in Macrophages)、网格蛋白介导的内吞信号(Clathrin-mediated Endocytosis Signaling)、急性期反应信号(Acute Phase Response Signaling)、法尼醇X受体/类视黄醇X受体激活(FXR/RXR Activation)、补体系统(Complement System)等通路。4.差异蛋白共参与3个主要的蛋白相互作用网络(参与网络的目的蛋白超过8个),其中Lipid Metabolism/Molecular Transport/Small Molecular Biochemistry网络中涉及差异蛋白15种(score值为34分),Cellular Movement/Hematological System Development and Function/Immune Cell Trafficking网络中涉及差异蛋白11种(score值为24分),而有8种差异蛋白则参与Cell Death and Survival/Hematological System Development and Function/Cancer的功能网络(score值为16分)。5.ELISA检测结果显示血清可溶性L-选择素蛋白的表达情况与i TRAQ结果一致,验证了L-选择素在儿童T-ALL血清中表达上调。结论1.本研究首次应用i TRAQ联合2DLC-MS/MS技术快速、有效地筛选儿童T-ALL与B-ALL血清差异蛋白分子标志物,得到了大量可靠的差异蛋白质信息,具有较高的重复性和精确性。2.L-选择素可能与儿童T-ALL发病有关,可作为新的肿瘤标志物及治疗靶点并可作为区分儿童T-ALL与B-ALL潜在的分子标志物,但需要进行更为广泛的临床验证。