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研究目的乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染一直是全球重大的卫生健康问题。尽管从90年代初实施了 HBV疫苗免疫接种计划,而且自1998年以来一直在使用有效的抑制病毒药物,我国仍有7000多万人患有慢性乙肝感染。HBV可通过病毒蛋白间的相互作用以及与宿主因子发生相互作用,维持cccDNA的稳定性,促进HBV的复制,导致HBV慢性感染,使得HBV的彻底治愈变得异常困难。因此,HBV复制表达机制及其治疗途径的研究具有重要意义。本实验室前期工作表明,ADAR1通过RNA编辑功能下调TTPA的表达从而促进HBV的复制,初步揭示了TTPA在体外实验中的抗HBV效果;另外通过改良生物素转换实验联合质谱分析,筛选出发生巯基化修饰的的蛋白,即Rab7A。因此,本研究进一步探究TTPA和Rab7A对下游效应分子的影响,为乙肝治疗提供新的靶点。研究方法本研究首先在完整HBV转基因鼠中分别注射AAV-TTPA和AAV-NC,通过ELISA、qPCR、IHC等方法检测注射AAV后对血清及细胞内HBV标志物的表达水平;HepG2.2.15细胞中转染TTPA质粒后,WB检测mTORC1下游效应分子S6K1磷酸水平的变化;通过双荧光素酶报告基因实验确定TTPA核心启动子区域活性,进一步通过ChIP、CoIP等实验确立影响TTPA启动子转录的可能机制;通过生物素转换实验确定Rab7A中功能性巯基化位点,分别过表达Rab7A以及突变质粒,应用ELISA、qPCR等方法检测细胞上清中和细胞内HBV标志物的表达水平,并用GTP结合能力实验进行验证Rab7A及突变体GTP结合能力的变化,用WB检测mTORC1下游效应分子S6K1磷酸水平的变化,通过CoIP等实验检测Rab7A与mTORC1的结合是否受巯基化修饰影响。研究结果1.完整HBV转基因鼠血清中TTPA组HBV表面抗原、HBV DNA、AST、ALT以及肝脏组织中HBV total RNA和3.5KB RNA的水平明显低于NC组(p<0.05)。2.在HepG2.2.15细胞中过表达TTPA促进p-S6K1和p-AKT的表达(p<0.05),当TTPA突变后(R59W)对p-S6K1、p-AKT和p-ERK无明显作用;TTPAR59W或添加RAP处理后对HBsAg的表达无影响;而mTORC1抑制剂雷帕霉素处理或者敲低TTPA明显减弱胰岛素对p-S6K1的促进作用(p<0.05)。3.双荧光素酶报告基因实验初步筛选出活性较高的核心启动子片段-TTPA200,通过生物信息软件预测结合ChIP、CoIP、双荧光素酶报告基因实验验证了转录复合物SP1/HBXIP/HBx 降低 TTPA 启动子的活性(p<0.05)。4.生物素转换实验Rab7A(Δ)蛋白的巯基化明显减弱。5.分别过表达Rab7A和Rab7A(Δ)后用NaHS处理细胞,Rab7A组细胞上清中细胞内HBV标志物表达水平明显低于对照组(p<0.05),CCC组无明显差异。6.Rab7A促进S6K1的磷酸化水平,GTP的结合能力依次为Q67L>Rab7A>Rab7A(Δ)>N125I(p<0.05),检测Rab7A及其突变体对mTORC1下游效应分子的影响,Q67L能明显促进S6K1的磷酸化水平,Rab7A(Δ)和N125I抑制p-S6K1的表达(p<0.05)。7.COIP实验验证了 Rab7A能与mTOR结合,用0.5%TX-100处理免疫沉淀复合物后,减弱了 Rab7A与mTORC1的结合,Rab7A以GTP依赖形式与mTOR结合。研究结论TTPA通过激活mTORC1信号通路抑制HBV的复制,HBx通过转录复合物SP1-HBXIP-HBx抑制TTPA启动子转录;Rab7A与mTOR结合具有GTP依赖性,进而调节mTORC 1信号通路,巯基化的Rab7A抑制HB V阳性细胞系HepG2.2.15细胞中HBV的复制。