一、研究背景及目的世界范围内,结直肠癌是第三大常见的来源于人类上皮组织的恶性肿瘤,在我国,其发病率甚至死亡率都居于所有的恶性肿瘤中的第五,是我国面临的公共健康考验。结直肠癌进展是由特定基因的遗传和表观遗传改变引起的,包括KRAS和BRAF等致癌基因的激活突变,以及肿瘤抑制基因功能的缺失,如APC和TP53[1,2]。Wnt通路的激活在结直肠癌的经典发病模式即正常上皮发展为腺瘤,最后演变为腺癌的早期过程中是具有显著影响的环节,而环指蛋白43（Ring finger protein 43,RNF43）是关键的Wnt通路抑制物,其突变的产生可能会使Wnt/β-catenin信号通路调控受损,从而驱动结直肠癌的进展。RNF43具备E3泛素-蛋白连接酶特性,可以靶向Wnt膜受体——卷曲蛋白（Frizzled,FZD）以及低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6（co-receptor low density lipoprotein receptor-related protein 5/6,LRP5/6）[3,4],进行内吞和降解。还可以与T细胞因子4（T cell factor 4,TCF4）结合,将其系结到细胞核膜上遏制基因转录,从而保持对Wnt信号的控制[5]。RNF43突变是致癌过程中的关键驱动事件,它消除了RNF43对Wnt信号的抑制作用,促进了腺瘤向癌的转变[6]。研究表明,在散发性结直肠癌中,RNF43突变率在18%左右,与微卫星不稳定性（Microsatellite Instability,MSI）联系紧密,与APC基因的失活突变相互排斥[7]。约70-80%的MSI-H（MSI-High,高频微卫星不稳定）型结直肠癌中出现了RNF43突变[8]。这些关键的RNF43突变上调了Wnt/β-catenin信号通路,与结直肠癌的驱动进程密不可分,所以,对RNF43突变功能的研究对结直肠癌的诊疗、预后评估有着重要意义,突变的RNF43基因可能识别出对Wnt抑制剂有反应的肿瘤。为了丰富RNF43不同位点突变的功能的研究,在本课题中,我们靶向分析了在人类癌症中发现的位于RNF43蛋白酶相关结构域（Protease Associated Domain,PA）的错义突变c.311T＞C与截短突变p.I47Vfs对Wnt信号的调控作用,从而评估是否能以此为靶点,选择Wnt抑制剂用于RNF43突变肿瘤患者的治疗。二、方法1.在就诊于大连医科大学附属第二医院肿瘤内科的两例患者的二代测序（Next-generation sequencing,NGS）资料发现RNF43存在有意义突变位点（c.311T＞C和p.I47Vfs）,分别获取了其RNF43突变序列。2.构建对应的RNF43变异质粒,转染HCT116细胞系,建立稳定转染的细胞系。3.利用q PCR、TOPFlash/FOPFlash双荧光素酶报告基因法、Western blot等方法检测上述细胞系中Wnt通路下游基因和蛋白的表达情况,综合分析RNF43c.311T＞C和p.I47Vfs突变对Wnt通路状态的影响。4.CCK-8实验探究RNF43以及突变体c.311T＞C和p.I47Vfs对结直肠癌细胞增殖的影响。5.根据现有的Wnt通路抑制药物（IWP-2、Salinomycin）作用于上述细胞系,筛选能够有效抑制RNF43突变引起的Wnt通路活化的抑制剂。三、结果1.RNF43在结直肠癌细胞中确有抑制Wnt信号通路的能力。2.RNF43 PA结构域错义突变c.311T＞C保留了对Wnt信号通路的抑制能力。3.RNF43截短突变p.I47Vfs异常激活了Wnt信号通路。4.RNF43-c.311T＞C和RNF43-WT抑制了肠癌细胞增殖,而RNF43-p.I47Vfs没有抑制作用。5.IWP-2、Salinomycin两种Wnt通路抑制剂可以抑制p.I47Vfs突变的肠癌细胞。四、结论结合文献相关报道与我们的研究结果可以表明:Wnt抑制剂只有对携带N端截短突变的结直肠癌才有效,而在PA结构域c.311T＞C错义突变的结直肠癌却并没有异常激活Wnt通路,保留了对Wnt的负调控,并对Wnt抑制剂没有反应。所以,在临床上,RNF43是否能作为Wnt抑制剂治疗的靶点还有待谨慎评估。