研究背景及研究目的烧伤是平时生活和战争中比较常见的疾病，浅度烧伤可以经过药物治疗后自愈，然而治愈深度烧伤最好的办法是皮肤移植。现在治愈大面积深度烧伤中皮肤移植是常用的方法，皮肤移植往往是自体皮肤移植，但自体皮肤移植往往存在的一个缺点就是自身可供移植的皮肤不够，不能完全覆盖创面，影响到治疗效果。科学家们曾经尝试用过同种异体皮肤移植来解决皮肤移植中供皮来源不足的问题，但同种异体皮肤往往伴激活免疫应答，免疫应答和免疫排斥导致皮肤移植的失败，为了解决这个问题，科学家们一直探索免疫耐受的机制，包括免疫细胞的特性，特别是抗原提呈细胞(APC)和调节性T细胞(Treg)。树突状细胞(DC)是一种功能强大的抗原提呈细胞，DC能够携带抗原信息，从外周器官迁移到淋巴组织的T淋巴细胞区，将抗原提呈给T淋巴细胞，激活活化初始T淋巴细。同时，DC可以通过诱导形成调节性T淋巴细胞，细胞克隆删除和删除记忆性T细胞，在形成免疫耐受和免疫排斥中起着重要作用[1,2]。这就使DC作为一种治疗方法在移植中探索应用。在动物实验中，输入捐助者或接收者来源的耐受性DC，可以更广泛地延长移植物的存活。在临床实验中，DC在移植中也开始应用，但仍存在很多问题需要解决，包括细胞的分离和纯化技术，细胞的来源和途径，以及如何靶向性的诱导免疫耐受等[3]。未成熟树突状细胞(immature dendritic cell，imDC)有着较高的抗原递呈能力以及较低的共刺激分子，能够诱导低免疫应答和产生免疫耐受，所以imDC成为了现在诱导免疫耐受研究的重点，这已经在我们以前国家自然科学基金项目(No.30271341)中得到证明。而我们在国家自然科学基金项目(No.30672173)也证实imDC转染CCR7后具有较高的迁移能力，将转染CCR7基因的imDC输入同种异体皮肤移植小鼠中后，其皮肤存活时间明显长于输入mDC组以及输入PBS组。因为imDC能够诱导免疫耐受，但具有较低的CCR7，所以在国家自然科学基金项目(No.30672173)中，我们试图通过腺病毒转染CCR7基因使供者源imDC的CCR7表达上升，增强imDCs的迁移及免疫耐受能力，但腺病毒转染imDC也会部分促使imDC向mDC分化，使共刺激分子升高，共刺激分子通过与相应受体结合，可为T细胞激活提供第二信号，再通过引发T细胞分化和相关细胞因子分泌等，对机体免疫起着正性作用，影响了诱导免疫耐受功能的发挥。如何使CCR7基因转染imDC后能够上升CCR7基因表达同时抑制共刺激分子的表达呢？现在研究发现，RelB基因能够调节共刺激分子的表达，下调RelB基因，能够下调共刺激分子。为更好的发挥供者源imDC的作用，我们尝试同时转染上调CCR7基因和下调RelB基因，使imDC有着较高迁移性的同时表达较低共刺激分子，更好的诱导形成免疫耐受，从而为延长同种异体皮肤的存活时间提供一个新的思路和方法。研究方法1、小鼠骨髓来源树突状细胞的形态及功能鉴定在体外，GM-CSF和IL-4联合培养诱导小鼠骨髓来源的单核细胞成为树突状细胞，第5天的细胞为imDC，而在7天时加入LPS刺激，形成mDC,通过光镜、电镜来观察细胞形态。流式细胞仪和蛋白电泳检测特异性标志分子和共刺激分子的表达。混合淋巴细胞反应和ELISA实验检测imDC和mDC功能的变化。2、小鼠趋化因子CCR7重组慢病毒感染对DC2.4细胞免疫原性和迁移功能的影响分别构建空载慢病毒和带有CCR7上升基因的慢病毒，并且带有绿色荧光蛋白，培养小鼠未成熟细胞细胞系DC2.4，用慢病毒感染DC2.4，分为三组，正常DC2.4组叫做DC2.4组，空载慢病毒感染DC2.4组叫做GFP-DC2.4，带有CCR7上升基因慢病毒感染DC2,4组，叫做CCR7-DC2.4。光镜和荧光显微镜下观察细胞形态，流式细胞仪，蛋白印迹法分别检测感染前后共刺激分子CD80和CD86的变化，激光共聚焦检测CCR7分子的变化，体外趋化实验检测体外趋化能力的改变。3、上调小鼠CCR7联合下调Rel-B基因对未成熟树突细胞免疫原性和迁移功能的影响设计RelB SiRNA，用CCR7腺病毒和Rel-B SiRNA同时转染imDC，用光学显微镜和荧光显微镜观察细胞形态和转染效率，用流式细胞仪检测CCR7的变化，趋化实验检测迁移功能的变化。加入LPS刺激使imDC变为mDC，蛋白电泳检测Rel-B的蛋白表达变化，流式细胞仪检测共刺激分子CD80和CD86的变化，混合淋巴细胞反应检测免疫原性的变化。实验结果1、小鼠骨髓来源树突状细胞的形态及功能鉴定1.1小鼠骨髓源树突状细胞体外培养光镜观察情况培养的第3天可见有树突状突起的细胞，形态上体积比较小，比较圆润，疏松贴壁并聚集成团呈集落样生长。至第5天突起逐渐增多，细胞团也逐渐增多，细胞体积增大，表面毛刺状突起明显，但仍然疏松贴壁生长，加入LPS刺激后可见细胞表面伸出比较明显的树突状样结构，长短大小不一，悬浮细胞数目增多和体积增大，突起明显增多增大。1.2小鼠骨髓来源树突状细胞扫描电镜观察结果从扫描电镜结果可见：imDC表面较光滑，但表面凹凸不平，毛刺状突起几乎没有。mDC表面不光滑，并且伸出许多树枝样突起，长短不一，形态各异，比较符合成熟DCs的典型细胞形态，为下一步功能实验奠定了基础。1.3小鼠骨髓源树突细胞按照上述方法分离，经IL-4、GM-CSF作用后，于第5天加入LPS刺激其向成熟转变，流式细胞术检测细胞表面分子CD11C,CD80,CD86,MHCⅡ的表达。在imDC中CD11c、CD80、CD86、MHCⅡ的阳性率分别低于在mDC的表达率，统计学显示，imDC和mDC的CD11C、CD80、CD86、MHCⅡ差异均有统计学意义(p<0.01)，这符合imDC低表达而mDC高表达表面分子的表型特征。1.4从蛋白电泳图上可以看出，成熟树突细胞的CD80、CD86表达明显高于未成熟树突细胞的蛋白表达。imDC的CD80蛋白表达量为（0.65±0.1），而mDC的蛋白表达量为（1.36±0.1），为imDC的2倍，存在明显差异(P<0.01)。imDC的CD80蛋白表达量为（0.54±0.1），而mDC的蛋白表达量为（1.47±0.08），为imDC的2.7倍，存在明显差异(P<0.01)。说明imDC受到刺激后，共刺激分子CD80和CD86会明显上升，为以后的进一步实验奠定基础。1.5通过单向混合淋巴细胞反应(MLR)来评价培养的imDC对同种异体未致敏T淋巴细胞的刺激能力，imDC刺激T细胞后OD值为：（1.33±0.31），mDC刺激T细胞后OD值为：（2.38±0.4），对T细胞的刺激能力是imDC的1.79倍，存在明显差异(P<0.01)。1.6通过ELISA结果显示，imDC分泌IL-2和IFN-γ量分别为(2848.37±162.67)pg/ml和(156.25±27.09)pg/ml，mDC分泌IL-2和IFN-γ量分别为(3610.36±106.59)pg/ml和(287.33±14.85)pg/ml，成熟树突细胞分泌IL-2和IFN-γ量明显高于未成熟树突细胞(P<0.01)。imDC分泌IL-4和IL-10量分别为:(186.56±6.6)pg/ml和(147.40±23.23)pg/ml，mDC分泌IL-4和IL-10为(106.5±5.3)pg/ml和(77.91±10.88)，imDC分泌IL-4量明显高于mDC(p<0.01)。从以上结果可以看出，mDC刺激T细胞分泌的细胞因子IL-2和IFN-γ明显高于imDC(p<0.01)，而imDC刺激T细胞分泌的IL-10和IL-4明显高于mDC(p<0.01)。2、小鼠趋化因子CCR7重组慢病毒感染对DC2.4细胞免疫原性和迁移功能的影响2.1光镜下观察DC2.4细胞呈贴壁生长，集落式生长，细胞形态呈圆形，慢病毒感染后细胞形态没有明显改变。24h后荧光显微镜下观察，就可以发现明亮的GFP表达，此后逐渐增强，并且在96小时达到荧光强度达到高峰，阳性率可以达到87.4%。2.2经过流式上机检测后，3组细胞CD80、CD86、MHCⅡ的表达阳性率分别为无明显差异。统计结果P值均大于0.05。2.3蛋白印记结果蛋白印记结果显示, CCR7-DC2.4组CCR7蛋白表达量(45.1±2.1)明显高于DC2.4(25.32±1.4)和GFP-DC2.4(28.6±0.9)(P<0.01)。 DC2.4、 GFP-DC2.4和CCR7-DC2.4的CD80表达量分别为33.9±2.2、33.2±1.6、32.9±1.8，三组无明显差别(P>0.05)。DC2.4、GFP-DC2.4和CCR7-DC2.4的CD86表达量分别为39.9±1.3、33.1±2.1、33.9±2.3，三组无明显变化(P>0.05)。2.4细胞免疫荧光结果细胞免疫荧光显示DC2.4细胞表达很低的CCR7，GFP-DC2.4细胞可表达少量CCR7，CCR7-DC2.4细胞CCR7的表达增加，说明慢病毒载有CCR7基因能够有效的转入DC2.4并表达CCR7蛋白。2.5体外迁移实验结果体外迁移实验表明,CCR7-DC2.4在CCL19作用下体外趋化迁移率(35.33±5.4)%明显高于DC2.4(5.5±0.6)%和GFP-DC2.4(6.34±0.6)%(P<0.01)。说明载有CCR7的慢病毒转染DC2.4后，使其迁移功能明显上升。3、上调CCR7联合下调Rel-B基因对小鼠未成熟树突细胞免疫原性和迁移功能的影响3.1培养的imDC和mDC形态同第一部分描述，用荧光显微镜观察，均能看到腺病毒感染的绿色荧光和SiRNA感染的红色荧光。说明腺病毒和SiRNA能够有效的转染DC。3.2用LPS刺激后，提取蛋白，检测Rel-B，从蛋白电泳结果中可以看出，共转染CCR7腺病毒和RelB SiRNA的DC表达较低Rel-B蛋白，明显低于mDC。3.3流式细胞仪结果显示，在转染后第一天，imDC在转染CCR7腺病毒和RelB-SiRNA后，CCR7阳性率表达明显上升，明显高于imDC组。在经过LPS刺激后。imDC在转染CCR7腺病毒和RelB-SiRNA后即使经过LPS刺激，其共刺激分子CD80和CD86阳性率低于mDC(P<0.01)，说明共转染转染CCR7腺病毒和RelB-SiRNA能够在LPS刺激时仍然保持较低的共刺激分子表达。3.3体外趋化实验结果在共转染后，用体外趋化实验检测各组细胞的迁移率，结果如下，imDC:(3.92+0.23)%，imDC+空Ad:(10.60+0.83)%，imDC+空SiRNA:(9.13+0.42)%，imDC+空Ad+空SiRNA:(17.50+1.0)%，imDC+Ad-CCR7:(33.83+2.47)%，imDC+Rel-B siRNA:(3.47+0.38)%，imDC+Ad-CCR7+Rel-B siRNA:(32.35+1.59)%，mdc:（29.38+1.02)%imDC在共转染CCR7腺病毒和RelB-SiRNA后其迁移效率明显高于imDC(P<0.01)，说明共转染转染CCR7腺病毒和RelB-SiRNA能够使imDC有较高的迁移效率。3.4混合淋巴细胞反映结果imDC在转染CCR7腺病毒和RelB-SiRNA后即使经过LPS刺激，并检测各组细胞对T细胞的刺激能力，imDC在转染CCR7腺病毒和RelB-SiRNA后即使经过LPS刺激，与T细胞共培养OD值明显低于mDC (P<0.01)。说明imDC在转染CCR7腺病毒和RelB-SiRNA后即使经过LPS刺激，对T细胞的刺激能力明显低于mDC对T细胞的刺激能力(P<0.01)。说明共转染CCR7腺病毒和RelB-SiRNA能够使imDC即使受到LPS等炎症因子刺激，也能够保持较低的刺激T细胞反应和较低的诱导免疫应答的能力。结论1、小鼠骨髓来源的单核细胞在应用GM-CSF和IL-4刺激诱导后能够成为imDC，在经过LPS刺激后能够形成mDC，并且具有典型形态特征2、流式细胞仪，蛋白印迹法和混合淋巴细胞反映结果证实imDC共刺激分子的表达和对T细胞的刺激能力明显低于mDC。3、ELISA结果显示，imDC和T细胞培养后分泌的IL-4和IL-10明显高于mDC，而mDC和T细胞培养后分泌的IL-2和IFN-γ明显高于imDC。4、蛋白印迹法和细胞免疫荧光显示，上调CCR7基因的慢病毒能够高效转染DC2.4，转染后CCR7基因蛋白表达明显上升。5、体外趋化实验显示，上调CCR7基因的慢病毒转染DC2.4后能够使DC2,4具有较高的迁移率。6、流式细胞仪结果和蛋白印迹法显示，上调CCR7基因的慢病毒转染DC2.4后DC2.4细胞的共刺激分子CD80和CD86表达变化不明显，说明慢病毒转染DC2.4对DC2.4的共刺激分子表达影响较小。7、流式细胞仪显示，imDC在共转染CCR7腺病毒和RelB-SiRNA后CCR7表达阳性率明显上升。共转染CCR7腺病毒和RelB-SiRNA的imDC在LPS刺激后，CD80和CD86共刺激分子的表达明显低于mDC，说明共转染CCR7腺病毒和RelB-SiRNA能够使imDC具有较高的CCR7的表达，同时当受到LPS刺激时，转染共CCR7腺病毒和RelB-SiRNA的imDC也同时能够保持较低的CD80和CD86的表达。8、体外趋化实验显示，imDC在共转染CCR7腺病毒和RelB-SiRNA后体外迁移率明显高于imDC。9、混合淋巴细胞反映显示，imDC在共转染CCR7腺病毒和RelB-SiRNA后受到LPS刺激后，对T细胞的刺激能力明显低于mDC。10、通过共转染CCR7腺病毒和RelB-SiRNA，我们诱导成了既有较高迁移功能的imDC，在迁移过程中，这种imDC受到炎症刺激，也能够表达较低的共刺激分子，从而能够更好的诱导免疫耐受，为进一步动物实验奠定良好的基础。