哺乳动物卵母细胞向胚胎的转化是生殖发育的关键环节,涉及多个重要的细胞生物学事件,且受一系列蛋白激酶的精确调控。Polo-like激酶(Plk1)是一种丝、苏氨酸蛋白激酶,在细胞分裂的多个阶段发挥着重要的作用。目前已有研究表明Plk1的功能涉及体细胞有丝分裂过程中的多个环节,但在猪卵母细胞减数分裂向胚胎有丝分裂转换这一特殊分裂进程中的功能却知之甚少。本研究主要通过间接免疫荧光染色和共聚焦显微镜技术结合蛋白质印迹以及特异性抑制剂处理等方法,对猪卵母细胞向胚胎发育进程中Plk1的表达与功能进行研究。在系统检测微管蛋白(α-Tubulin)和微丝蛋白(F-actin)在卵母细胞成熟分裂及胚胎首次有丝分裂过程中表达特点的基础之上,我们系统检测了 Plk1在猪卵母细胞减数分裂及胚胎首次有丝分裂过程中的表达与亚细胞定位;在此基础之上,选用高度选择性的Plk1抑制剂,GSK461364,来研究Plk1在猪卵母细胞减数分裂和胚胎首次有丝分裂过程中的潜在功能,以期进一步揭示Plk1激酶在猪卵母细胞减数分裂向胚胎有丝分裂转换这一特殊进程中的调控作用。试验结果如下:试验一、猪卵母细胞MⅠ期向MⅡ期转化过程中Plk1的动态表达与亚细胞定位首先通过免疫荧光技术系统地检测了卵母细胞在MⅠ期向MⅡ期转换过程中的细胞骨架变化。结果发现,在猪卵母细胞(MⅠ)期和第二次减数分裂中期(MⅡ)期时,α-Tubulin组装成对称、桶状的典型纺锤体。F-actin在紧邻皮质区域大量富集形成微丝帽结构;至第一次减数分裂末期(TⅠ)期,α-Tubulin分布在两组分离的染色体之间,微丝在细胞皮质区域形成收缩环以促进第一极体(pbl)的排出。免疫印迹结果显示,在猪卵母细胞减数分裂过程中,Plk1在各阶段都有不同程度的表达,且其表达水平在MⅠ期达到最大值;免疫荧光检测结果显示,在MⅠ和MⅡ时期,Plk1对称分布在皮质区域的染色体两侧,富集于α-Tubulin形成的桶状纺锤体上,与α-Tubulin具有相似的分布规律;至TⅠ期,观察到Plk1分布于染色体中间区域。这些结果表明在卵母细胞MⅠ期向MⅡ期转化过程中Plk1的表达和定位与纺锤体等亚细胞结构有着密切的时空相关性。试验二、抑制Plk1对MⅠ期卵母细胞成熟和纺锤体、染色体结构及Mad2和BubR1蛋白表达的影响采用Plk1特异性抑制剂GSK461364处理MⅠ期卵母细胞后,大部分经处理的卵母细胞未能排出第一极体,导致卵母细胞体外成熟失败;采用Western blot技术检测Plk1和磷酸化Plk1(p-Plk1)在猪卵母细胞中的表达水平,结果发现GSK461364作用猪卵母细胞后Plk1磷酸化水平也显著降低,这表明Plk1激酶活性可能在猪卵母细胞MⅠ期向MⅡ期的转变过程中起着关键作用。之后我们对GSK461364处理后卵母细胞的分裂进程也进行了分析,结果发现大部分对照组卵母细胞排出了 pbI处于MⅡ期阶段,而经GSK461364处理的卵母细胞停滞在ATI期的比例显著上升。最后,我们采用1.2 μM的GSK461364处理MⅠ期卵母细胞,将其培养至36h后,通过共聚焦显微镜观察发现大多数卵母细胞纺锤体的结构正常,而染色体分离却发生严重缺陷。上述结果表明,抑制MⅠ期卵母细胞Plk1会引起成熟分裂过程中染色体分离发生缺陷进而导致细胞周期进程阻滞在ATI期。此外,我们对ATI期两种动粒蛋白Mad2和BubR1的表达水平进行检测发现,GSK461364处理对BubR1蛋白表达无明显影响,但显著降低了 Mad2蛋白的表达水平。提示Plk1被抑制后,染色体分离缺陷伴随着Mad2蛋白表达水平的显著降低。以上结果表明,Plk1可能在猪卵母细胞ATI期通过调控动粒蛋白Mad2蛋白的表达进而参与染色体分离的调节。试验三、猪胚胎首次有丝分裂过程中Plk1的动态表达与亚细胞定位首先系统检测了胚胎首次有丝分裂这一特殊时期细胞骨架的动态分布规律。结果显示α-Tubulin在前中期聚集形成网状结构;中期,α-Tubulin在中央区域组装成对称的典型纺锤体结构;后期,α-Tubulin牵引姐妹染色单体向两级移动;末期,α-Tubulin组装成中体结构;微丝在末期富集于分裂沟下方,形成收缩环。在此基础之上,我们采用Western Blot技术对胚胎首次有丝分裂各时期Plk1的表达水平进行了系统地分析,结果发现Plk1在胚胎首次有丝分裂各时期均有明显表达,并在22 h表达量最高。激光共聚焦结果显示,Plk1在前中期富集于细胞核附近;中期,Plk1富集于染色体两边呈对称分布;进入后期,Plk1迁移至细胞两极;末期,Plk1富集于中体。以上结果提示Plk1在猪早期胚胎首次分裂过程中的表达与功能可能与纺锤体的组装有一定的相关性。试验四、GSK461364对胚胎细胞有丝分裂与纺锤体、染色体形态的影响经Plk1特异性抑制剂GSK461364处理44h后,导致处理组的多数胚胎细胞首次有丝分裂失败。提示Plk1对猪早期胚胎首次有丝分裂具有重要的调控作用。对上述对照组与处理组的细胞用Hoechst 33342染色后,在共聚焦显微镜下对其进行有丝分裂进程的统计学分析,结果显示,经GSK461364处理后,大多细胞未能完成首次卵裂,而停滞在前中期。用100 nM的GSK461364处理细胞20 h,处理组大多数细胞表现为纺锤体的结构异常和染色体的错误排列。这些结果提示Plk1可能主要通过调节胚胎前中期纺锤体的组装与染色体的精确排列进而参与胚胎首次有丝分裂进程的调控。