论文部分内容阅读
Na~~+,K~~+-ATPase,又称钠泵,是高等真核生物细胞膜上普遍存在的一种特殊的膜结合蛋白,它在维持体内渗透压的平衡、稳定细胞膜电位、信号转导等方面具有重要作用。Na~~+,K~~+-ATPase是由α和β亚单位组成的异源二聚体,其中α亚单位是催化亚单位,它贯穿嵌入膜中,有10个跨膜区(M1～M10),具有酶的活性和许多钠泵调节因子的结合位点,其中M4～M5区直接参与了ATP的催化水解。钠泵α亚基有α1、α2、α3、α4四种亚型,各异构体间功能各异,具有种属特异性,近期的研究表明,钠泵α2亚基与高血压的发生和发展具有很大关系。本研究拟构建钠泵α2亚基M4～M5膜内区蛋白BB4-5的原核表达体系,表达并纯化目的蛋白,制备Na~+-K~+-ATPaseα2亚基的单克隆抗体,为进一步研究钠泵α2亚基在体内的作用机制,及与疾病发生的关系奠定基础。一、钠泵α2亚基M4-M5区蛋白的克隆和表达目的:利用基因重组技术构建钠泵α2亚基M4-M5膜内区蛋白的表达载体,IPTG诱导表达获得蛋白,通过蛋白纯化技术将蛋白纯化,为钠泵α2亚基单抗制备提供抗原。方法:(1)钠泵α2亚基M4-M5克隆载体的构建。以质粒YhNα2(含人钠泵α2亚基cDNA序列)为模板,PCR扩增得到α2亚基M4-M5区的基因片段BB4-5,将其加尾后连接至克隆载体pGM-T并转化大肠杆菌DH5α,挑选阳性克隆,得到质粒PGMT-BB4-5。(2)钠泵α2亚基M4-M5蛋白表达体系的构建。从质粒PGMT-BB4-5上切下目的基因片段,双酶切连接到表达载体pET28b(+)上并转化入大肠杆菌Rosetta2,挑选阳性克隆,得到质粒pET28b(+)-BB4-5。双酶切验证目的基因序列是否正确。1%接种表达菌,用终浓度为0.4 mM的IPTG进行诱导,SDS-PAGE电泳检测重组蛋白的表达。(3)重组蛋白的纯化:将菌体破碎,SDS-PAGE电泳分析目的蛋白存在的形式,将包涵体变性和复性后,用Ni-NTA亲和柱进行纯化,检测目的蛋白的纯度。(4)重组蛋白的Western blotting分析:将Ni2~+亲和层析纯化后的融合蛋白经SDS-PAGE蛋白电泳后,电转移到硝酸纤维素膜上,封闭,加入钠泵α2亚基抗血清或抗His抗体,洗膜,DAB显色试剂盒进行显色,凝胶成像仪照相。结果:(1)以质粒YhNα2为模板进行PCR扩增得到基因片段BB4-5,产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测,在相应的位置出现明显的条带。将其加尾后连接至pGM-T载体并转化入大肠杆菌DH5α,挑选阳性克隆扩增并提取质粒,双酶切和测序结果显示基因序列与理论一致。(2)将目的基因片段与同样双酶切的PET28b(+)表达载体相连,转化Rosetta2感受态细胞,在含Kan的平板上筛选重组子。双酶切结果表明蛋白表达体系构建成功。用IPTG诱导表达后,SDS-PAGE结果表明,BB4-5目的条带与理论值一致。(3)菌体破碎后,经SDS-PAGE电泳分析表明,表达产物主要以包涵体形式存在,将包涵体用盐酸胍变性,梯度稀释复性后,用Ni-NTA亲和柱进行纯化,得到纯度在90%以上的目的蛋白。(4)表达产物BB4-5经Western blotting分析,可与钠泵α2亚基的抗体及抗His抗体特异性结合。结论:本研究成功的构建了钠泵α2亚基M4-M5蛋白表达载体pET28b(+)-BB4-5,经IPTG诱导表达,Ni-NTA亲和柱进行纯化,得到纯度在90%以上的目的蛋白,可作为抗原来制备钠泵α2亚基单抗。二、钠泵α2亚基单抗的制备与鉴定目的:以钠泵α2亚基M4-M5膜内区重组蛋白为抗原,免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术制备单克隆抗体,并采用ELISA间接法和免疫印迹对单克隆抗体的特性进行和鉴定,为探明钠泵α2亚基在体内的作用机制,及其与疾病发生的关系奠定基础。方法:(1)将α2亚基纯化蛋白作为抗原,免疫6~8周BALB/c小鼠。(2)通过杂交瘤技术来筛选α2亚基的单克隆抗体:取被免疫动物的脾细胞(B淋巴细胞),与Sp2/0骨髓瘤细胞杂交;用间接ELISA法筛选阳性(抗体分泌)细胞;将阳性细胞通过有限稀释法进行克隆化,直接获得可稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系,建株。(3)以小鼠腹水法制备杂交瘤的粗制单克隆抗体,采用辛酸-硫酸铵沉淀法将抗体进行纯化。(4)采用Sigma公司小鼠mAb Ig亚类检测试剂盒检测抗体的亚型。(5)采用Western-blotting法检测抗体的特异性。(6)参照Beatty的方法,采用间接ELISA法测定抗体的亲和常数。结果:(1)6~8周BALB/c小鼠免疫后,测得小鼠血清抗体效价均为1:50000以上。(2)选取抗体效价较高的小鼠分离脾细胞,采用常规方法与Sp2/0骨髓瘤细胞进行融合,通过多次间接ELISA实验进行筛选,检测出阳性孔有14孔,克隆化后得到两株效价较高细胞株。(3)小鼠腹腔接种杂交瘤细胞株,收集腹水,通过辛酸-硫酸铵沉淀法进行纯化,得到纯化的mAb。(4)通过小鼠mAb Ig亚类检测试剂盒检测两株mAb的亚型均为IgG2a。(5)Western-blotting结果显示两株mAb与钠泵M4-M5膜内区蛋白特异性结合。(6)测定两种细胞株分泌的mAb亲和常数分别为3.51×108L/ mol和5.88×107 L/ mol。结论:利用基因重组表达的钠泵M4-M5膜内区蛋白作为抗原,通过杂交瘤技术,成功制备两株单克隆抗体,并采用间接ELISA法和免疫印迹对其进行鉴定。该单抗的获得,为进一步探讨钠泵α2亚基在体内的作用机制,及其与疾病发生的关系奠定基础。