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本文主要从以下几个部分展开论述： 第一部分 MiR-9-1过表达及miR-9-5p海绵慢病毒载体构建及其慢病毒包装 背景及目的：近年来，许多研究表明microRNAs可靶向目的基因调节肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移及耐药等生物学功能。通过华大基因测序肺腺癌细胞A549顺铂敏感株及耐药株老鼠移植瘤组织，结果发现miR-9-5p在A549/DDP(顺铂耐药株)组织中表达较A549细胞中低，TGFBR2基因在A549/DDP(顺铂耐药株)组织中高表达。查阅生物信息学网站预测：TGFBR2为microR-9-5p的靶基因，而miR-9-1是miR-9-5p的重要编码基因。为验证miR-9-5p靶向调节TGFBR2基因表达并探索miR-9-5p对肺腺癌A549及A549/DDP细胞顺铂耐药、增殖的影响，构建含miR-9-1基因过表达miR-9-5P的载体及敲低miR-9-5p的海绵，并包装慢病毒，以便后续试验研究。 方法：采用实时荧光定量PCR(fluorescent quantitative real-time pcr，qRT-PCR)验证miR-9-5p、TGFBR2在A549和A549/DDP细胞系中的表达差异，采用western blot进一步验证TGFBR2在A549及A549/DDP细胞系中的蛋白表达差异。通过miRBase及Ensembl genome browser87网站设计miR-9-1基因目的片段，PCR克隆长538bp的片段，酶切后连接于PCDH513B载体，转化及测序鉴定过表达质粒；根据miR-9-5p成熟体序列设计敲低miR-9-5p的吸附海绵并由华大基因公司合成；采用二代慢病毒质粒包装miR-9-5p过表达及敲低病毒。 结果：华大测序分析预测：与A549细胞相比，miR-9-5p在A549/DDP细胞中的表达明显偏低，是A549细胞中的12.2%，然而TGFBR2在A549/DDP中的表达是A549细胞中的2.08倍。qRT-PCR及western blot实验验证发现：miR-9-5p在A549/DDP细胞中的表达是A549细胞中43.54%，在A549/DDP细胞中TGFBR2的mRNA水平比A549细胞中高2.94倍；同样，TGFBR2蛋白量在A549/DDP细胞中表达增高。PCR克隆出538bp目的片段，成功构建于PCDH513B载体，测序验证正确，miR-9-1过表达载体及miR-9-5p海绵分别包装于293T细胞，72小时细胞显示GFP荧光。 结论：miR-9-5p在A549细胞中表达比A549/DDP细胞高；相反，TGFBR2的mRNA水平及蛋白量在A549/DDP细胞中比A549细胞中高；与测序结果吻合。成功构建miR-9-1过表达载体及miR-9-5p海绵病毒，并成功包装慢病毒。 第二部分 miR-9-5p靶向TGFBR2调控肺腺癌细胞对顺铂耐药性及增殖的研究 目的：构建TGFBR2的3’UTR（3’端非编码区）载体，通过海肾双荧光报告基因系统验证miR-9-5p对TGFBR2基因表达的调节作用。qRT-PCR验证miR-9-5p表达量改变对A549及A549/DDP细胞中TGFBR2表达的调节。观察miR-9-5p通过调节TGFBR2基因对A549及A549/DDP细胞株顺铂耐药性及增殖的影响。 方法：(1)双荧光报告基因实验：构建TGFBR2的3’UTR载体，并与miR-9-5p模拟物或对照物共转染293T细胞，裂解细胞，加入底物反应，采用酶标仪读取双荧光信号，计算OD值。 (2)采用miR-9-1过表达慢病毒感染A549/DDP细胞株，上调miR-9-5p在A549/DDP细胞中的表达，同时使用miR-9-5p海绵慢病毒感染A549细胞株，敲低miR-9-5p在A549细胞中的表达；qRT-PCR验证感染后miR-9-5p及其靶基因TGFBR2在两细胞株中的表达变化，Western blot进一步验证TGFBR2蛋白慢病毒感染后两细胞中的变化。 (3)PCR克隆TGFBR2基因的编码序列（CDS），构建于PCDH513B载体，转化、摇菌，华大测序鉴定，商业购买敲低TGFBR2基因表达的shRNA。将上诉两载体包装于慢病毒。 (4)TGFBR2过表达慢病毒感染A549细胞，上调TGFBR2在A549细胞中的表达；TGFBR2-shRNA慢病毒感染A549/DDP细胞，敲低TGFBR2在A549/DDP细胞中的表达。qRT-PCR及western blot鉴定TGFBR2过表达及敲低是否成功。 (5)CCK-8实验检测以下细胞系：A549细胞及A549/DDP细胞，不同慢病毒感染后，miR-9-1过表达的A549/DDP细胞，miR-9-5p敲低的A549细胞，TGFBR2过表达的A549细胞，TGFBR2敲低的A549/DDP细胞，对比上述细胞对顺铂的耐药性的差异及增殖速度的变化。 结果：（1）海肾双荧光报告基因实验显示：miR-9-5p可降低293T细胞荧光素酶的表达。 （2）miR-9-1过表达慢病毒感染A549/DDP细胞株后，miR-9-5p表达是对照组的6.36倍，TGFBR2mRNA水平下降到33.19%。miR-9-5p海绵慢病毒感染A549细胞株后，与对照组比，miR-9-5p表达降低到26.7%；然而，TGFBR2mRNA水平增高，是对照组的1.42倍。 （3）用miR-9-1过表达慢病毒感染A549/DDP细胞后，其耐药性及增殖速度均低于对照组；同样，在A549/DDP细胞中敲低TGFBR2表达后，其耐药性及增殖速度也低于对照组。在A549细胞中，用miR-9-5p海绵慢病毒感染A549敲低miR-9-5p后，其对顺铂的耐药性及增殖速度均高于对照组，在A549细胞细胞中敲低TGFBR2的表达，对其顺铂的耐药性及增殖速度的影响与敲低miR-9-5p的结果相似。 结论：TGFBR2基因是miR-9-5p的直接调控靶点，miR-9-5p可以调节A549及A549/DDP细胞中TGFBR2基因的表达。MiR-9-5p可通过靶向TGFBR2基因调节肺腺癌细胞的顺铂耐药性、增殖速度。 第三部分 miR-17-92簇高表达与恶性肿瘤患者预后关系的meta分析 目的：采用meta分析评估miR-17-92簇的高表达在肿瘤患者中的预后价值。 方法：检索Web of Science、PubMed、EMBASE数据库中从建库至2015年10月1日关于miR-17-92簇成员高表达与恶性肿瘤患者预后关系的英文文献；提取关键数据,计算合并风险比(hazard ratio，HR)及其95%置信区间(confidence interval,CI)。 结果：共纳入39篇文献,包含4908例患者。miR-17-92簇的高表达与恶性肿瘤患者总生存率(HR=1.83,95%CI:1.58-2.12,P=0.000)低有关。并且miR-17-92簇高表达的肿瘤患者的无病生存率(HR=1.80,95%CI:1.43-2.26,P=0.000)、无进展生存率(HR=1.83,95%CI:1.11-3.02,P=0.018)及肿瘤特异性生存率(HR=1.59，95%CI:1.04-2.42,P=0.032)均降低；然而无复发生存率的合并风险比无统计学意义(P=0.539)。 结论：miR-17-92簇高表达与恶性肿瘤的不良预后有关，有望成为新型肿瘤预后标志物。