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杨树炭疽病(poplar anthracnose)是主要由胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioide)引起的一种严重影响杨树健康的枝和叶部病害,在我国南北广大的各种杨树种植区均有不同程度的危害。目前防治杨树炭疽病最广泛、有效的方法还是化学防治,但长期和不合理地使用化学农药带来环境污染和引起病原菌产生抗药性等问题日益严重。因此,开发绿色、有效的替代防治手段尤其重要,利用拮抗微生物及其代谢产物防治杨树炭疽病是一种有效的途径。本研究的目的是筛选对杨树炭疽病具有高效防病效果的内生拮抗细菌,并探究其抑菌活性物质,从而为生物防治杨树炭疽病菌剂的开发和应用提供高效生防菌株和前期理论基础。本研究从北京地区采集的11份健康杨树叶片中共分离到35株内生细菌。以杨树炭疽病菌胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides)为指示菌,采用平板对峙法,筛选到了一株具有高效拮抗活性的内生细菌XW2,温室防治效果检测表明菌株XW2对杨树炭疽病的防效达到49.1%。基于培养特征、形态特征、生理生化特征及16S rRNA序列比对,最终将菌株XW2鉴定为萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)。萎缩芽孢杆菌XW2能产生多种真菌细胞壁裂解酶。其无菌发酵滤液和菌体裂解液均能有效抑制杨树炭疽病菌的菌丝生长和孢子萌发,抑制菌丝生长形成的抑菌圈直径分别达到22.3 mm和12.1 mm;处理24 h后对孢子萌发的抑制率分别达到94.6%和88.8%。此外无菌发酵滤液和菌体裂解液还能导致被抑制的菌丝和萌发孢子的芽管产生局部膨大的畸形,其中萌发孢子的畸形率达到100%。从发酵滤液和菌体裂解液中提取的脂肽类物质抑制杨树炭疽病菌生长形成的抑菌圈直径分别为23.2 mm和11.8 mm;而提取的蛋白类物质的抑菌圈直径分别为22.3 mm和13.4 mm。菌株XW2产生的挥发性气体也能抑制杨树炭疽病菌菌丝生长和孢子萌发,对菌丝生长的抑菌率达到60.2%,且导致生长的菌丝产生大量分枝状弯曲的菌丝。采用响应面优化法对萎缩芽孢杆菌XW2的发酵培养基进行优化。以无菌发酵滤液对杨树炭疽病菌的抑菌率为响应值,从8种初始发酵培养中筛选出改良的3号培养基为基础发酵培养基,Plackett-Burman(PB)设计从初始发酵培养基的8个组分中筛选出葡萄糖、蛋白胨和酵母浸粉为关键因素;最陡爬坡试验确定了三个关键因素的最大响应区域;中心复合设计和响应面分析确定了三个因素的最佳浓度,最终获得的最优发酵培养基为:葡萄糖(22.64 g/L)、NH4C1(3.00 g/L)、KH2P04(1.00 g/L)、Na2HP04(1.00 g/L)、MgS04.7H20(0.50 g/L)、酵母浸粉(1.85 g/L)、蛋白胨(11.93 g/L)和大豆粉(5.00 g/L)。优化后,无菌发酵滤液的抑菌率提高了 52.15%,胞外脂肽和蛋白的抑菌率分别提高了 44.84%和44.83%。此外,优化后的无菌发酵滤液对多种病原真菌均表现出较强抑菌活性,抑菌率在69.55%～100%之间。萎缩芽孢杆菌XW2胞外脂肽有效抑制了杨树炭疽病菌菌丝生长和孢子萌发,并使菌丝和萌发孢子的芽管产生局部膨大的畸形。胞外脂肽对杨树炭疽病菌的最小抑菌浓度(MIC)和有效抑制中浓度(EC50)分别为0.01 mg/disc和0.044 mg/mL。经胞外脂肽处理后,杨树炭疽病菌细胞膜通透性和菌丝甘油含量明显提高,胞外多糖(EPS)的分泌则明显降低。此外,胞外脂肽还能完全抑制杨树炭疽病菌在杨树叶片上的生长和扩展,并能有效抑制11种不同的植物病原真菌,抑菌圈直径在12.3～19.2 mm之间。胞外脂肽在高温、酸碱、多种蛋白酶(木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K)、紫外或长时间常温保存处理下,抑菌活性依然保持很好的稳定性。胞外脂肽还表现出显著的生物表面活性的特性。最后采用UPLC-Q-Exactive四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱分析技术鉴定胞外脂肽中含有C15～C17伊枯草菌素A和C12～C17表面活性素。萎缩芽孢杆菌XW2胞外蛋白对杨树炭疽病菌菌丝生长和孢子萌发具有显著的抑制作用,并使菌丝和萌发孢子的芽管产生局部膨大的畸形,对杨树炭疽病菌的最小抑菌浓度(MIC)和有效抑制中浓度(EC50)分别为0.01 mg/disc和0.036 mg/mL。也能有效抑制杨树炭疽病菌在杨树叶片上的生长和扩展,对11种不同的植物病原真菌也具有较好的抑菌活性,抑菌圈直径在11.6～18.6 mm之间。此外,胞外蛋白在温度110℃条件下处理30 min及pH 6.0～9.0的范围内均能保持较高的抑菌活性;对多种蛋白酶(木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K)、紫外光照、金属离子(Li+、Na+、K+、Ag+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+)、SDS、EDTA 或长时间常温保存处理均不敏感,但Mn2+和Fe3+会抑制蛋白的抑菌活性,而Tween 20和H202则能提高蛋白的抑菌活性。萎缩芽孢杆菌XW2挥发性气体具有较好的抑菌广谱性,对12种不同的植物病原真菌均具有不同程度的抑菌活性,抑菌率在7.0%～88.9%之间。GC-MS分析从挥发性气体中分离鉴定出了 14种挥发性化合物,包括醛类、苯类、醇类、酮类、烯烃类、烷烃类等,占挥发物质总量的46.29%,其中1,3-二氯苯是含量最高的组分(相对含量为11.88%)。从市面购买了 10种挥发性化合物纯品并分别检测抑菌活性。其中,3-乙基苯甲醛表现出最强的抑菌活性,在施药浓度为10 μL/plate时能完全抑制12种不同植物病原真菌的生长。