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以不同方法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,应用超顺磁性氧化铁(SPIO,Superparamagnetic iron oxide)即Fe203-多聚左旋赖氨酸(PLL)的偶联物及羰花青荧光染料(DiI 1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindo-Carbocyanine perchlorate)标记大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),构建BMSCs-SPIO-DiI生物探针,同种异体移植治疗大鼠颈总动脉创伤,应用7Tmicro-MR仪进行活体成像,为干细胞移植并活体无创示踪提供实验依据。
无菌条件下分离大鼠双下肢,低糖DMEM培养液冲出骨髓,分别运用全骨髓贴壁法和密度梯度离心法体外分离骨髓间充质干细胞,利用差速贴壁原理对细胞进行纯化扩增,在倒置相差显微镜下连续观察细胞的形态变化,体外培养、传代、扩增。制备Fe203-PLL,对分离纯化并传代培养的大鼠BMSCs标记Fe203-PLL,细胞移植前,羰花青荧光染料标记,构建BMSCs-SPIO-DiI生物探针。普鲁士蓝染色显示细胞内铁,荧光显微镜显示红色荧光,胎盼蓝拒染法检测细胞活率,观察标记前后细胞的生长状况。12只急性颈总动脉创伤大鼠模型分成实验和对照两组,将标记细胞(实验组,n=6)和未标记细胞(对照组,n=6)同种异体经过尾静脉移植入大鼠体内,在移植前、移植后3h及3、7、12d应用MR的PD-T2及3D-FLASH序列对大鼠颈总动脉进行活体成像,测量创伤处管壁信噪比(signal-to-noise ratio,SNR),并与相应颈总动脉组织切片普鲁士蓝染色及荧光显像对照。
与密度梯度离心法相比,全骨髓贴壁法分离获得的骨髓间充质干细胞贴壁时间短,增殖快,经传代后能够纯化。原代培养8~10d后可分离得到骨髓间质干细胞,且骨髓充间质干细胞体外培养生长状况良好,呈均一的成纤维细胞样,传代周期为3-4d。BMSCs-SPIO-DiI标记率近100%,普鲁士蓝染色及电镜显示蓝色铁颗粒位于MSCs胞质内,荧光显微镜下胞浆内示红色荧光。标记对细胞活率及生长状况无明显影响。实验组和对照组移植前、移植后3h及3、7、12d创伤颈动脉的SNR分别为14.52±2.14,13.47±1.13,4.22±2.16,5.51±2.15,12.90±1.56;14.31±3.12,15.12±2.23,14.10±1.79,14.63±3.47,14.17±2.82。与注射前比较,实验组3、7d创伤颈总动脉的SNR下降,差异具有统计学意义(Dunnett检验,t值分别为10.03,8.01,P值均<0.05),3h及12d时SNR虽仍较低,但差异无统计学意义(Dunnett检验,t值分别为1.09,1.25,P>0.05)。对照组移植后各时间点与移植前比较,SNR改变差异无统计学意义(方差分析,F= 0.139,P>0.05)。组织学示红色荧光及普鲁士蓝阳性细胞主要分布于颈总动脉创伤周围病变区。
采用全骨髓贴壁法可稳定获得均质性良好的大鼠骨髓间充质干细胞,效果优于密度梯度离心法。SPIO-DiI可以对BMSCs进行安全有效的标记,双标构建纳米生物探针;标记对细胞活率及生长状况无明显影响。7Tmicro-MR仪可对磁粒子标记的BMSCs经尾静,脉移植后定向归巢至颈总动脉创伤处进行活体示踪,创伤处血管组织学示红色荧光及普鲁士蓝染色阳性,证实了MRI低信号改变系移植的干细胞归巢。