家蚕丝腺是合成丝蛋白的重要器官，家蚕丝腺中的丝氨酸蛋白酶抑制剂是一类重要的蛋白酶抑制剂，有研究报道其可能和家蚕丝蛋白的合成和保护有关。要阐明家蚕丝蛋白高效特异合成的机理，家蚕丝腺中丝氨酸蛋白酶抑制剂的调控作用是关键问题之一，但目前其相关研究报道还较少。2003年本实验室成功绘制了家蚕基因组框架图，2006年完成了家蚕全基因组的寡核苷酸芯片的研制以及从基因水平、表达水平和蛋白质水平建立了功能基因组研究平台，为我们系统分析家蚕丝腺丝氨酸蛋白酶抑制剂的种类、结构特征和进化关系提供了研究基础和技术保障。本研究首先利用蛋白质研究方法对家蚕丝腺中的胰蛋白酶抑制剂多态性进行了调查，然后利用分子生物学和生物信息学方法对家蚕丝腺中的丝氨酸蛋白酶抑制剂进行了全基因组数据鉴定，对其中重要的抑制剂基因进行了克隆和原核表达。主要结果如下： 1．家蚕丝腺中丝氨酸蛋白酶抑制剂的多态性调查利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native—PAGE)和胰蛋白酶抑制剂(TI)活性染色方法对25个家蚕品系丝腺的胰蛋白酶抑制剂的多态性分布进行了调查，电泳图谱分析表明在家蚕丝腺中共检测到6种TIs，按迁移度分别命名为：TI—Ⅰ、TI—Ⅱ、TI—Ⅲ、TI—Ⅳ、TI—Ⅴ和TT—Ⅵ，不同品系中所含的TI种类不同。以家蚕大造为例，我们对同一品系不同组织器官中的TI类型进行调查发现，TI在组织间存在多态性，丝腺中的TI种类与其它组织含有的TI种类不同，具有特异性。以家蚕品系大造和21-872为例，对不同品系5龄不同发育时期丝腺的TI种类进行调查发现，品系不同，TI种类不同；而不同的TI种类其活性检测到的发育时期不同，但所有TI种类的活性都随着发育时期的进行而逐渐增强，吐丝第2天达到最大，后慢慢降低，蛹第1天时几乎检测不到活性。 2．家蚕茧壳中丝氨酸蛋白酶抑制剂的理化性质初探利用Native—PAGE和TI活性染色方法，我们对家蚕陈旧茧壳中的TI活性进行了调查，发现家蚕陈旧茧壳中的TI活性较新鲜茧壳相对降低，个别TI种类活性甚至消失。利用不同pH和温度处理家蚕茧壳发现，TI种类不同，其对酸碱和温度的稳定性不同，其中TI—Ⅵ对pH和温度最稳定。 3．家蚕丝腺丝氨酸蛋白酶抑制剂的种类、结构特征和进化关系利用家蚕全基因组数据、基因芯片和EST数据，对家蚕丝腺中的丝氨酸蛋白酶抑制剂进行了全基因组数据鉴定，在家蚕丝腺中共鉴定了14种丝氨酸蛋白酶抑制剂特异高量表达，分别命名为：BmSPIs1～BmSPIs14，都有EST证据。利用NCBI中的BIAST工具和结构预测工具SMART对这14种丝氨酸蛋白酶抑制剂的结构进行了预测，结果显示BmSPIs3、BmSPIs4、BmSPIs5、BmSPIs6、BmSPIs7和BmSPIs8具有Serpin型结构域；BmSPIs1、BmSPIs2和BmSPIs9具有TIL结构域；BmSPIs12、BmSPIs13和BmSPIs14属于Kunitz型结构域；BmSPIs11属于Kaza1型结构域；而BmSPIs10既有Serpin又有TIL结构域。采用ClustalW程序和MEGA程序中的邻接法对这14种丝氨酸蛋白酶抑制剂与其它物种中的丝氨酸蛋白酶抑制剂构建进化树发现，相同结构域的抑制剂首先聚在一起，说明家蚕丝腺特异高量表达的这四种结构域的丝氨酸蛋白酶抑制剂在物种间是比较保守的。 4．家蚕丝腺丝氨酸蛋白酶抑制剂的克隆和原核表达利用RT—PCR技术，我们对家蚕丝腺特异高量表达的BmSPIs5、BmSPIs6、BmSPIs8、BmSPIs13和BmSPIs14五种抑制剂进行了组织表达谱验证，进一步对这5个基因进行了TA克隆，获得了完整的编码序列。利用大肠杆菌表达系统，表达了BmSPIs6，获得了较纯的BmSPIs6蛋白样品。 我们希望通过对丝腺特异高量表达的丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究，为了解其在丝腺生长发育中发挥的重要作用和阐明丝蛋白高效特异合成的机理提供理论数据支持。