玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)是镰刀菌产生的真菌毒素,主要污染玉米、小麦和高粱等谷物及其制品,具有生殖毒性、免疫毒性和潜在致癌性等。该毒素可通过污染谷物及其制品或残留有ZEN的肉、奶等进入人和动物体内,给畜牧业发展和人类健康造成严重威胁。鉴于玉米赤霉烯酮在农产品、食品中的广泛污染及居民膳食中的暴露水平,大多数国家现已制定了谷物及制品中ZEN的最大允许量。目前,用于ZEN检测的方法有薄层层析法、高效液相色谱法及免疫分析法等。其中,免疫分析法基于抗原抗体特异性结合,具有检测灵敏度高、特异性好、前处理简便、分析快速、成本低廉等优点,适用于食品安全行业中的批量样品的初步筛检。但建立该方法,需使用大量ZEN标准物及有机溶剂合成检测抗原,同时还需ZEN标准物建立标准曲线,对操作人员的身体健康存在着潜在的危害。另外,实验过程中的废液,还可能造成周边环境的二次污染。本课题以玉米赤霉稀酮为研究对象,用抗独特型纳米抗体模拟其分子结构,研制出ZEN替代抗原,并建立了 ZEN绿色免疫分析方法,降低了 ZEN对操作人员的危害及对环境的污染,为ZEN污染的监控提供了灵敏、快速、简便、环保的新方法。本研究的主要内容为:1.首次从羊驼免疫纳米抗体库中淘选获得ZEN替代抗原的抗独特型纳米抗体,研究建立了基于纳米抗体替代抗原的免疫分析方法,为其他真菌毒素等毒性污染物的绿色免疫分析研究提供了新的技术平台。以2D3抗体为抗原免疫羊驼,分离血液中白细胞并抽提RNA,采用重链抗体铰链区特异性引物,克隆获得两类不同亚型的重链抗体IgG2a及IgG3的重链可变区片段(VHH),大小在400-600 bp之间。将扩增得到的VHH片段与载体pComb3X连接,电转化到大肠杆菌ER2738,通过M13K07辅助噬菌体侵染获得库容量为4.6×107pfu的纳米抗体库。经过四轮亲和淘选,获得一株能与2D3抗体可变区特异性结合的噬菌体展示纳米抗体,优化抗体包被浓度、噬菌体滴度、pH值、甲醇浓度等条件,建立基于噬菌体展示纳米抗体的ELISA检测方法。基于phage 8#的ELISA法具有较高的检测灵敏度,对ZEN的IC50值为0.207ng/mL。将纳米抗体表达纯化,直接用作包被抗原,对包被浓度、抗体2D3浓度、pH值、盐离子浓度、甲醇浓度等条件进行优化,建立相应的抑制曲线,对ZEN的IC50值为0.118ng/mL;以玉米、小麦和饲料三种空白样品作为基质进行玉米赤霉烯酮的添加回收试验,添加回收率在71.7%～102.2%之间。2.首次将纳米抗体用作ZEN替代标准物,研究建立了基于纳米抗体替代标准物的快速检测方法,开辟了玉米赤霉烯酮绿色免疫分析的新途径。将纳米抗体VHH-8#用作玉米赤霉烯酮替代标准物,以纳米抗体VHH-8#的浓度作为横坐标,以ELISA检测的B/B0值作为纵坐标,建立标准曲线,在相同的B/B0下,VHH-8#浓度与ZEN浓度呈良好的线性关系(R2=0.984),以VHH-8#浓度为横坐标,ZEN浓度为纵坐标,建立VHH-ZEN关系曲线。运用两步法测定样品中玉米赤霉烯酮含量,首先根据OD值计算VHH-8#浓度,再通过VHH-8#与ZEN的线性相关方程,得出玉米赤霉烯酮含量。选取玉米、小麦和饲料样品,分别建立三种基质的定量转换方程,测定ZEN的添加回收率,结果在80.8%～101.3%之间。此外,对纳米抗体VHH-8#进行耐热性能检测,结果表明纳米抗体具有很好的温度稳定性。因此,本课题研制的纳米抗体替代标准物能够很好地应用于实际样品中玉米赤霉烯酮的检测,且具有较好的稳定性。