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【研究背景】 SCN1A基因编码哺乳动物电压门控钠通道的α亚基，它是钠通道的功能性单位，所编码的蛋白命名为Nav1.1，主要在抑制神经元中表达。Dravet综合征是一种难治性的癫痫性脑病，目前研究已经明确SCN1A基因是Dravet综合征的重要致病基因之一，约70％-80%的Dravet综合征患者携带SCN1A基因异常，其中大约50%基因突变是无义突变和移码突变,引起蛋白翻译被提前终止从而生成功能异常的截短蛋白。SCN1A基因截短突变生成提前终止翻译的密码子(PTC)，可能会诱导无意密码子介导的mRNA降解(NMD)发生，他是一种广泛存在于真核细胞中的mRNA的质量监督机制，该机制通过识别和降解含有PTC的转录产物，防止生成功能异常的截短蛋白。SCN1A基因截短突变能否激发NMD机制，降解含有PTC的mRNA尚无相关研究。 目前SCN1A基因截短突变对钠通道功能的影响机制存在两种假说，包括单倍剂量不足(Haploinsufficiency)和显性负效应(Dominant-Negative Suppression)。单倍剂量不足是指单一拷贝正常基因翻译的蛋白质不足以维持正常功能，是导致人类疾病发生的一个重要因素。显性负效应是指截短蛋白与野生型(WT)蛋白发生相互作用而影响野生型蛋白的功能。 氨基糖苷类抗生素可以通过提高无义突变的翻译读通效率，从而产生全长的蛋白，部分恢复突变体的结构与功能。氨基糖苷类抗生素对SCN1A基因无义突变的翻译读通的修复作用尚不明确。 【研究目的】 本研究选取Dravet综合征（DS）的患者在SCN1A基因不同位置的截短突变的位点，分析患者的临床特点与突变信息，使用实验室前期已构建的相关minigene，研究在SCN1A基因上不同位置的截短突变能否激发无义密码子介导的RNA降解机制（NMD），以及下游截短蛋白的表达，分析NMD机制与临床表型的关系，并选取其中一个无义突变，使用氨基糖苷类抗生素进行不同药物浓度干预，研究该药物对SCN1A基因无义突变的翻译修复的作用。 【研究方法】 详细收集本课题所研究的不同位置 SCN1A基因截短突变的 Dravet综合征（DS）患者的临床资料及分析突变特点，使用实验室前期已构建融合表达绿色荧光蛋白（GFP）的不同位置的 SCN1A基因截短突变的 minigene。选取人类神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y细胞）、NGF诱导的褐家鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（NGF诱导的PC12细胞）为质粒转染对象，使用脂质体法转染技术，摸索转染质粒浓度、转染质粒到提取细胞总RNA所需的间隔时间，确定转染质粒浓度与转染后提取总RNA的时间，将去内毒素minigene质粒分别转染上述两种细胞系，分为放线菌酮（CHX）处理6小时组与未处理组，分别提取细胞的总RNA，经逆转录得cDNA，以cDNA为模板，Kana基因为内参基因，进行实时荧光定量PCR（Realtime-PCR）。比较SCN1A基因的WT及截短突变型质粒在两种不同细胞系中的mRNA相对表达量，同时比较CHX处理组与未处理组mRNA相对表达量的变化，每组实验重复三次获得均值。将minigene质粒转染NGF诱导的PC12细胞，48h后提取细胞的总蛋白，进行western blotting检测，使用光密度法统计 WT及截短突变型质粒蛋白水平变化。选取无义突变 c.4547C>A的minigene质粒转染NGF诱导的PC12细胞，转染后18h，加用不同浓度的氨基糖苷类抗生素，药物处理48h后提取总蛋白，进行western blotting检测。相对定量数据处理(采用2-△△Ct法)，所有数据以均数±标准误（X±SE)表示，使用SPSS13.0软件包(SPSS lnc.，Chicago，IL，USA)进行统计分析；两组样本均数比较采用t检验，三组以上两两比较采用One-Way ANOVA。以P＜0.05认为具有统计学意义。 【结果】 1．临床资料分析：携带截短突变c.4547C>A，c.5280_5281delTG，c.5621_5622delGG截短突变位点的患者均诊断为SMEI，携带截短突变c.5540-5541insCCAG突变的患者诊断为 SMEB，其中携带截短突变 c.5540-5541insCCAG，c.5621_5622delGG的患者同时符合孤独症诊断，携带c.5540-5541insCCAG患者孤独症儿童行为量表(简称ABC量表)78分，儿童孤独症评定量表（简称 CARS量表）36分，而携带c.5621_5622delGG突变的患者ABC量表110分，CARS量表41分。 2．PEGFP-C2-SCN1A–minigene野生型及突变型质粒鉴定：将实验室前期已构建野生型 minigene质粒与突变型 c.4547C>A，c.5280_5281delTG，c.5540-5541insCCAG，c.5621_5622delGG的质粒分别使用KpnI、NheI酶切鉴定，并送测序，证实质粒序列正确。 3．用于转染质粒的两种细胞系内源性Kana基因表达的鉴定：经过鉴定NGF诱导的PC12细胞,SH-SY5Y细胞均无內源Kana基因表达。 4．RNA的质量检测：经琼脂糖凝胶电泳鉴定所制备的totalRNA完整性可以用于荧光定量PCR实验。 5．转染质粒浓度确定：摸索不同浓度minigenen质粒转染，SCN1A基因mRNA降解率的变化。可见100ng转染时，降解率最大，选定100ng为最终转染六孔板的质粒的量。 6．质粒转染后提取totalRNA时间确定：摸索不同时间间隔提取细胞总RNA，SCN1A基因mRNA降解率的变化。16h提取，降解率最大，选定16h为最终转染后提取totalRNA的时间。 7．荧光定量PCR引物扩增效率鉴定：经鉴定Qpcr-NMDegfp-F1、Qpcr-NMDE24-R1与Q-kana-F1、Q-kana-R1两对引物的扩增效率差异小于5%，可使用2-△△Ct算法。 8．Realtime-PCR检测截短突变SCN1A基因 mRNA的相对表达量：NGF诱导的PC12细胞与SH-SY5Y两种细胞系中SCN1A基因不同位置截短突变的mRNA均较WT降低，差异有统计学意义；使用CHX处理后，突变质粒的mRNA较相应未处理时均有不同程度的恢复，差异有统计学意义，而WT处理前后变化不大；其中在SH-SY5Y细胞系中，c.5621_5622delGG、c.5540-5541insCCAG mRNA的表达率均较c.4547C>A，c.5280_5281delTG高，差异有统计学意义。 9．截短蛋白western Blotting结果：在NGF诱导的PC12细胞中转染目的质粒，48h后提取总蛋白，以GAPDH基因为内参基因，经过统计学分析 c.4547C>A，c.5280_5281delTG，c.5621_5622delGG较 WT明显降低，差异有统计学意义；c.5540-5541insCCAG与 WT比较无统计学差异； c.5540-5541insCCAG较 c.4547C>A，c.5280_5281delTG，c.5621_5622delGG截短蛋白表达水平高，差异有统计学意义。10．氨基糖苷类药物对无义突变翻译修复的作用 使用不同浓度3mg/ml、6mg/ml庆大霉素处理转染了c.4547C>A minigene的NGF诱导的PC12细胞，提取总蛋白，western Blotting检测，可见与WT大小一致的蛋白条带出现。 【结论】 1. SCN1A基因截短突变能触发NMD机制，不同位置的截短突变所诱发的NMD机制导致mRNA降解量不同。 2. Dravet综合征患者中SCN1A基因截短突变的NMD机制可能影响疾病的临床表型。 3. SCN1A基因截短突变所诱发的NMD机制在不同细胞系中表现不同，转染效率较高的细胞系可能部分掩盖NMD机制。 4.氨基糖苷类药物能够抑制SCN1A基因无义突变导致的提前出现的终止密码子，使翻译继续进行，表达全长的Nav1.1蛋白。