番茄SlAMSH3基因果实特异过表达载体的构建及遗传转化

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泛素蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome pathway,UPP)在植物生长发育过程中,包括激素合成、自交不亲和、感知下游信号传导、植物形态建成、抗病、表观遗传等过程都发挥重要作用。此外,细胞内还有另一类起反向调节解离泛素链分子的去泛素化蛋白酶。AMSH3酶就是去泛素化酶家族中MPN(+)/JAMM()蛋白酶家族的一员,能结合泛素化蛋白上的泛素分子,通过水解泛素分子羧基末端的酯键,肽键或异肽键,从连有泛素的蛋白底物或者前体蛋白上将泛素分子特异地脱离出来,重新进入细胞内蛋白调节的循环中。去泛素化酶对植物的生长发育和生理过程很重要,但是目前人们对泛素和去泛素化酶的相关研究还很少。  本研究在番茄中发现了一去泛素化酶基因,lAMSH3,通过Sol GenomicsNetwork网站生物信息比对,发现番茄SlAMSH3基因与拟南芥去泛素化酶基因AtAMSH3在核酸水平和蛋白水平分别有81%和71%的相似性。在拟南芥中,去泛素化酶AtAMSH3是生长素调节因子PIN2进行高效细胞内吞作用所必须的,能水解植物体外和体内积累的K48-和K63-两种泛素链,影响植物液泡的形成和液泡蛋白的运输途径。而amsh3突变体植株不仅不能形成中央裂解大液泡和积累吞噬体,还会将液泡蛋白错误分类运输到细胞间隙中。分子克隆中,使用果实特异性表达启动子TFM7比使用CaMV35S等组成型启动子效果更佳。因此,本研究构建了SlAMSH3果实特异过表达载体pBI121-TFM7-SlAMSH3和融合报告基因的表达载体pART27-35s-SlAMSH3-GFP,并将pBI121-TFM7-SlAMSH3载体转化到野生型番茄中,经筛选获得SlAMSH3在果实中高表达阳性株系,通过半定量RT-PCR分析和荧光定量PCR分析植株SlAMSH3基因表达水平,将pART27-35s-SlAMSH3-GFP载体在烟草中瞬时表达,通过融合报告基因定位法对SlAMSH3蛋白进行亚细胞定位,并测定绿熟期果实叶绿素含量及红熟期果实的单果重量、果实糖度、果实硬度、番茄红素含量和β-胡萝卜素含量,初步分析SlAMSH3基因对番茄品质的影响。  本研究结果表明,转基因番茄植株的果实中SlAMSH3基因表达水平提高了4倍,且SlAMSH3蛋白只在细胞核中表达;转基因番茄果实的叶绿素总含量、番茄红素和β-胡萝卜素比野生型分别提高178.61%,40.53%和74.86%,而转基因番茄果实的单果重量、果实糖度、果实硬度及果实直径等其他指标没有显著性差异。因此,SlAMSH3果实特异过表达的方法能够改良番茄果实品质,提高了番茄的营养价值和经济价值,也为采用基因工程方法改良番茄果实品质做出新尝试。
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