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目的7探讨黄芩素对小鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡和自噬的调控作用,及其具体的信号通路。方法实验首先将60只C57BL/6小鼠(雄性,20-30g)随机均分为三组,即假手术组、脊髓损伤组和黄芩素治疗组。(1)假手术组作中仅手术切除T9-T10的椎板;(2)脊髓损伤组利用改良的Allen,s法构建脊髓损伤模型;(3)黄芩素治疗组在脊髓损伤组基础上腹腔注射黄芩素溶液(100mg/Kg),治疗每日一次从手术之后开始,并持续4周。治疗同时对小鼠进行BMS评分与斜扳试验评分,并在第7天处死、取脊髓、切片和提取蛋白。利用切片进行尼式染色实验,观察组织中神经元的数量变化;利用组织蛋白进行Western blot实验,观察自噬相关蛋白(p-PI3K、LC3-B、Beclin-1和P62)的变化;利用切片进行免疫荧光双标及透射电镜实验,观察神经元中LC3B蛋白表达情况及组织自噬小体数量变化情况;利用蛋白和切片进行Western blot及TUNEL染色实验,观察凋亡相关蛋白(Caspase 3、Caspase 9、Bax和Bcl-2)的表达情况和凋亡特异性染色TUNEL染色的改变情况。实验随后将40只C57BL/6小鼠(雄性,20-30g)随机均分为四组,即脊髓损伤组、脊髓损伤后注射3-MA组、黄芩素治疗组和黄芩素治疗后注射3-MA组。小鼠处理后7天处死、取脊髓组织、切片并提蛋白。利用提取的组织蛋白进行Western blot实验,观察自噬相关蛋白(Beclin-1)和凋亡相关蛋白(Bax和Bcl-2)的变化情况;利用组织切片进行免疫荧光双标及TUNEL染色实验,观察神经元中Beclin-1蛋白变化情况及凋亡特异性染色(TUNEL染色)的表达变化情况。结果脊髓损伤后治疗的第7,14,21,28天,黄芩素治疗组中BMS评分和斜板实验评分明显升高。对治疗7天后的小鼠进行分析发现,神经元特异性染色中黄芩素组中的神经元数量明显升高;黄芩素也可明显降低P62蛋白表达,并提高LC3-Ⅱ/LC3-I和Beclin蛋白水平;而且,黄芩素治疗可促进LC3B阳性细胞存活,同时治疗后自噬小体数量明显增加。同时,黄芩素治疗组可明显减少凋亡相关蛋白Caspase-3,Caspase-9,and Bax/Bcl-2的表达,并且减少TUNEL阳性细胞比例。当加入3-甲基腺嘌呤抑制PI3K通路后,黄芩素的激活自噬作用和抗凋亡作用明显降低,表现为:Beclin-1和Bcl-2的蛋白表达水平明显降低,而且Bax的表达量显著增加,Beclin-1阳性细胞明显降低,TUNEL阳性细胞比例增加。结论我们探讨了黄芩素在小鼠脊髓损伤疾病模型中对神经元的保护作用。黄芩素可通过激活神经元自噬从而抑制其凋亡,从而促进损伤后运动神经功能的恢复,此作用机制可能与PI3K信号通路有关。