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目的:1.利用SD雌性大鼠脊髓打击损伤模型,研究低氧预处理(Hypoxia Preconditioning,HPC)激活PI3K/AKT/Nur77/RXRα通路对大鼠脊髓损伤后神经元凋亡的影响。2.利用H2O2诱导PC12细胞建立细胞损伤模型,研究胰岛素样生长因子-1(Insulin-like Growth Factor-1,IGF-1)预处理激活PI3K/AKT/Nur77/RXRα通路对PC12细胞凋亡的作用及机制。3.综合动物实验和细胞实验的研究结果,为进一步检测脊髓损伤大鼠和低氧预处理大鼠血液和脑脊液各项指标的改变奠定坚实的理论基础。方法:1.建立大鼠低氧预处理模型,低氧时保持环境中氧浓度为8%(约为海拔8125m),每天处理大鼠2h,连续处理7d,之后采用Allen’s打击法制作脊髓损伤模型(打击力度200g/cm~2),术后1d、3d、7d、14d、21d、28d分别对大鼠进行神经功能评分评估各组大鼠后肢运动功能,采用HE染色、免疫荧光染色检测各组大鼠脊髓损伤程度和相应神经元凋亡状态,并行免疫印迹法(WB法)检测相关因子在蛋白水平表达情况。2.高分化PC12细胞建立细胞损伤模型,分别用不同浓度H2O2(10μM、50μM、100μM、200μM和300μM)处理细胞不同时长,在细胞损伤后3h、6h、12h、24h分别检测细胞活力,确定用药浓度及给药时间。用同样的方法确定IGF-1(PI3K激活剂)和LY294002(PI3K抑制剂)的用药浓度及作用时间。IGF-1的给药浓度分别为25μg/L、50μg/L和100μg/L,各处理12h、24h后对细胞活力进行测定;LY294002给药浓度分别为10μM、25μM和50μM,各处理12h、24h后测细胞活力。最后根据细胞活力决定H2O2、IGF-1和LY294002的给药浓度和作用时间。造模成功后,用细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(CCK-8法)测定各组细胞在特定波长下的吸光度值并确定细胞活力,对各组细胞活力进行比较;同时进行吉姆萨染色,观察各组细胞在形态学方面发生的变化。使用Hoechst33258活细胞染液对细胞核进行荧光染色,通过细胞核颜色对比确定各组细胞凋亡状况。然后采用WB法检测各组细胞相关蛋白的表达变化,探索IGF-1预处理对PC12细胞损伤后凋亡产生的影响。结果:1.与脊髓损伤组相比,低氧预处理后大鼠的后肢运动表现更佳,神经功能恢复更迅速。术后1d和3d,脊髓损伤组和低氧预处理+脊髓损伤组的BBB评分结果相近,二组比较无明显差异。在术后7d,低氧预处理+脊髓损伤组大鼠运动功能恢复情况变化明显,较术后1d和3d明显改善。术后14d、21d、28d该组大鼠运动功能维持在较高水平,且不断向假手术组趋近。因术后3d至7d时间段内大鼠BBB评分改变(增加)与其它时间段的结果相比升高最明显,我们推测低氧预处理在术后7d对大鼠影响最显著,因此,在后续实验中,我们均使用术后7d的大鼠脊髓进行实验。低氧预处理后大鼠脊髓损伤部位损伤面积较脊髓损伤组小,损伤程度较轻且运动神经元存活数量较后者多;低氧预处理后大鼠神经元凋亡数量较脊髓损伤组减少,且凋亡相关蛋白Bax、Caspase-3、Nur77、RXRα表达量少于脊髓损伤组;HIF-1α在低氧预处理后表达量较损伤组明显增多。2.IGF-1与低氧预处理一样,也可以通过影响PI3K/AKT/Nur77/RXRα通路对细胞凋亡的进展产生相应影响。IGF-1预处理后PC12细胞活力较H2O2组高且细胞形态更完整,细胞凋亡改变也无后者显著,细胞生长状态更佳;与H2O2组相比,IGF-1预处理后PC12细胞凋亡相关蛋白Caspase-3、Nur77、RXRα表达减少且促进改善细胞凋亡的相关因子PI3K、AKT表达增多。结论:1.脊髓损伤或神经细胞损伤后细胞凋亡现象显著。2.激活PI3K/AKT/Nur77/RXRα通路可抑制细胞凋亡,起神经保护作用。3.低氧预处理和(或)IGF-1可以激活PI3K/AKT/Nur77/RXRα通路发挥神经保护作用。