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目的:γ-氨基丁酸（GABA）是中枢神经系统重要的抑制性神经递质,参与调节多种神经系统相关疾病的发生发展,但越来越多的证据表明GABA的多种生物学作用尚不能完全用抑制性神经递质解释。组蛋白乙酰化修饰对基因转录调控具有重要的作用,组蛋白乙酰化主要依赖于组蛋白乙酰转移酶和组蛋白去乙酰酶（HDACs）的催化,HDACs催化组蛋白和一些非组蛋白的赖氨酸残基去除乙酰基,进而使组蛋白乙酰化水平升高,抑制相应基因转录活性。进而抑制基因转录。目前已有多种组蛋白乙酰化酶抑制剂被发现,如β-羟基丁酸、曲古抑菌素A、丁酸等,GABA与BHB、丁酸在结构上高度相似,但GABA是否可以抑制HDACs,目前尚不清楚。据报道,GABA可以上调脑源性生长因子、突触素、谷氨酸受体1（GluR1）、谷氨酸受体2（GluR2）等基因的表达水平,上述基因的表达又可被HDACs抑制。提示GABA可能具有抑制HDACs作用,但有待证实。GABA在脑中含量丰富,主要由神经元合成并释放至突触间隙,通过与突触后膜上的特异性GABA受体结合发挥功能。脑内合成的GABA不能自由透过血脑屏障（BBB）,外周组织的GABA主要来源于食物或肠道菌群的生物合成,少量可经GABA转运体（GATs）途径穿过BBB。GABA作为神经递质在神经系统中的作用已被广泛证实,随着研究的深入,GABA在外周的作用逐渐受到关注。脂肪组织表达GATs,但未见GABA受体在脂肪组织表达的相关报道。研究表明GABA对脂肪的某些功能具有调节作用,然而,这些调节作用是否通过非受体途径,以及是否与抑制HDACs有关,则有待证明。GABA与阿尔茨海默病（AD）、癫痫、帕金森症、多发性硬化等多种疾病有关。其中GABA在AD发生发展中的作用日益受到重视。AD是一种以进行性认知功能障碍和行为损害为特征的中枢神经系统退行性病变。β淀粉样蛋白（Aβ）清除功能障碍在AD的发生发展中起到不可忽视的作用。脑内Aβ的清除具有多种途径,酶降解是清除Aβ的一种重要方式,中性内肽酶（NEP）是脑内降解Aβ的重要蛋白酶之一,在AD脑中检测出NEP表达显著下降,当NEP表达升高时可减少Aβ并善认知功能损伤。BBB转运至外周也是清除脑内Aβ的重要途径,前期研究显示AD小鼠脂肪组织脂蛋白酯酶（LPL）表达降低,进而使脑微血管内皮细胞LPL减少,影响脑内Aβ跨BBB转运。另有证据表明,HDACs参与AD的发生发展,HDAC2/3可以通过调节AD相关基因,改变组蛋白H3K9/H4K12的水平,进而调控AD的发生发展。HDACs可以调控神经细胞NEP和脂肪细胞LPL的表达水平。然而,GABA是否可以通过抑制HDACs调节脑组织NEP和脂肪组织LPL进而发挥拮抗AD的作用,尚未证实。本研究结合体内、体外实验,选择GluR2作为GABA的下游靶基因,证明了GABA可以通过非受体途径抑制HDACs,并进一步探究了GABA拮抗AD的作用及其可能机制。研究结果不仅有助于诠释GABA广泛的生物学功能,还可为探寻AD的有效防治提供科学依据。方法:1.GABA对SH-SY5Y细胞及小鼠脑组织HDACs抑制作用的研究1.1 GABA处理的SH-SY5Y细胞活力的检测:选用人神经母瘤细胞系（SHSY5Y）,以GABA（终浓度为0～320 n M）处理细胞,培养24 h,采用MTT方法检测细胞活力。1.2 GABA处理的SH-SY5Y细胞HDAC1/2/3表达及AceH3K9/H4K12水平的检测:以0～20 n M GABA处理SH-SY5Y细胞,培养24h,采用qRT-PCR和Western Blotting检测HDAC1/2/3 mRNA及其蛋白表达,以及Ace-H3K9、Ace-H4K12的表达水平。1.3 GABA处理的小鼠脑组织HDAC1/2/3、GluR2表达及Ace-H3K9/H4K12水平的检测:将4月龄C57BL/6小鼠分为对照组和GABA处理组;GABA处理组小鼠腹腔注射100mg/kg.bw GABA,对照组小鼠注射等量生理盐水,12 h后乙醚麻醉处死小鼠。采用分光光度法检测小鼠脑组织GABA含量,采用qRT-PCR和Western Blotting检测脑组织HDAC1/2/3、GluR 2mRNA及其蛋白的表达,以及Ace-H3K9、Ace-H4K12的表达。1.4沉默HDAC1/2/3的细胞GluR2表达的检测:以siRNA分别沉默SH-SY5Y细胞HDAC1/2/3,同时设立对照组,培养24 h,采用qRT-PCR和Western Blotting检测GluR2 mRNA及其蛋白表达,并采用Ch IP方法检测GluR2启动子区域组蛋白乙酰化水平。1.5 GABA处理的SH-SY5Y细胞GluR2表达的检测:采用qRT-PCR和Western Blotting方法检测以GABA（20 n M）处理的细胞GluR2 mRNA及其蛋白表达水平,并采用Ch IP方法检测细胞GluR2启动子区域组蛋白乙酰化水平。2.GABA通过非受体途径抑制HDACs表达的研究2.1 GABA受体激动剂处理的SH-SY5H细胞HDAC1/2/3表达的检测:使用GABA-A/-C受体激动剂蝇蕈醇（100 n M）、GABA-B受体激动剂（R）-Baclofen（100 n M）处理SH-SY5Y细胞,同时设立对照组,培养24 h,采用qRT-PCR和Western Blotting检测细胞中HDAC1/2/3 mRNA及其蛋白表达。2.2 SHSY5Y细胞及3T3-L1细胞GABA受体表达的检测:使用qRT-PCR、Western Blotting及免疫荧光法检测SH-SY5Y细胞、小鼠脂肪前体细胞（3T3-L1）GABA受体表达情况。2.3 GABA处理的3T3-L1细胞活力的检测:以GABA（终浓度为0～320 n M）处理3T3-L1细胞,培养24 h,采用MTT方法检测细胞活力。2.4 GABA处理的3T3-L1细胞HDAC1/2/3表达及Ace-H3K9/H4K12水平的检测:以0～10n M GABA处理细胞并培养24 h,采用qRT-PCR和Western Blotting检测HDAC1/2/3 mRNA及其蛋白表达,以及Ace-H3K9、Ace-H4K12的表达水平。2.5 GABA处理的小鼠脂肪组织HDAC1/2/3表达及AceH3K9/H4K12水平的检测:小鼠分组及处理同上述（1.3）,采用qRT-PCR和Western Blotting检测脂肪组织HDAC1/2/3 mRNA及其蛋白表达,以及AceH3K9、Ace-H4K12的表达水平。3.GABA对AD的拮抗作用及其机制探讨将5月龄APPswe/PS1d E9双转基因小鼠分成AD模型组和AD干预组,野生型小鼠分成野生对照组和野生干预组。干预组小鼠喂饲含有2%GABA水溶液,对照组小鼠喂饲普通蒸馏水,连续处理6个月,实验末期检测小鼠神经行为学指标,再将小鼠处死,。采用免疫组化法检测小鼠脑组织Aβ沉积情况。采用qRT-PCR和Western Blotting检测小鼠脑组织NEP、脂肪组织LPL mRNA及其蛋白表达,并采用免疫荧光法检测小鼠脑微血管内皮细胞LPL表达,qRT-PCR和Western Blotting检测小鼠脑组织、脂肪组织HDAC1/2/3 mRNA及其蛋白表达,以及Ace-H3K9、Ace-H4K12的表达水平。4.数据处理与统计分析:采用SPSS20.0建立数据库,进行统计分析。两两比较采用最小显著差值法,各组数值比较采用单因素方差分析法。结果表示为均数±标准差,P<0.05时差异有统计学意义。结果:1.GABA对SH-SY5Y细胞及小鼠脑组织HDACs的抑制作用1.1 GABA对SH-SY5Y细胞活力的影响:与对照组相比,5 n M、10 n M、20 n M GABA处理的SH-SY5Y细胞活力无统计学差异（P>0.05）;40 n M、80 n M GABA处理的SH-SY5Y细胞活力随着GABA浓度的增加而逐渐升高;160 n M、320 n M GABA处理后细胞活力随着GABA浓度的增加而逐渐降低,差异均有统计学意义（P<0.01）。1.2 GABA对细胞HDAC1/2/3、AceH3K9/H4K12表达的影响:与对照组相比,5 n M、10 n M、20 n M GABA处理的细胞HDAC1/2/3表达均下降,Ace-H3K9/H4K12表达水平上升,差异均具有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。1.3 GABA对细小鼠脑组织HDAC1/2/3、AceH3K9/H4K12表达的影响:GABA腹腔注射小鼠脑组织GABA含量表达升高（P<0.05）、脑组织HDAC1/2/3表达均下降、Ace-H3K9/H4K12表达水平上升,差异均具有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。1.4 GABA、HDACs对下游靶基因GluR2表达及启动子区域乙酰化水平的影响:GABA处理的细胞和腹腔注射GABA小鼠脑组织中GluR2表达升高（P<0.01）;沉默HDAC1/2后细胞GluR2表达升高（P<0.01）,但沉默HDAC3 GluR2的表达无统计学差异（P>0.05）;GABA处理及沉默HDAC1/2的细胞GluR2启动子区域Ace-H3K9表达水平升高,差异均具有统计学差异（P<0.01）。2.GABA通过非受体途径抑制HDACs的表达2.1 GABA受体激动剂对SH-SY5Y细胞HDAC1/2/3的影响:GABA-A/-B/-C受体激动剂处理SH-SY5Y细胞后,HDAC1/2/3 mRNA及蛋白表达无统计学差异（P>0.05）。2.2 SH-SY5Y细胞、3T3-L1细胞GABA受体表达情况:SHSY5Y细胞表达GABA受体,3T3-L1细胞未见GABA受体表达。2.3 GABA对3T3-L1细胞活力的影响:与对照组相比,2.5、5、10 n M GABA处理的3T3-L1细胞活力无统计学差异（P>0.05）,当GABA浓度超过20 nm时,细胞活力随着GABA浓度的增加逐渐下降,差异具有统计学差异（P<0.01）。2.4 GABA对脂肪细胞、脂肪组织HDAC1/2/3及整体乙酰化水平的影响:与对照组相比,GABA处理的3T3-L1脂肪细胞和小鼠脂肪组织HDAC1/2/3 mRNA及蛋白的表达均下降,差异具有统计学意义（P<0.05,P<0.01）;Ace-H3K9、Ace-H4K12表均达升高（P<0.01）。3.GABA对AD的拮抗作用及其可能的机制3.1 GABA对AD模型小鼠认知功能的影响:与野生对照组小鼠相比,AD模型组小鼠及AD干预组小鼠的水迷宫平台停留时间明显缩短、穿台次数明显减少（P<0.05,P<0.01）;与AD模型组小鼠相比,AD干预组小鼠的平台停留时间明显延长、穿台次数明显增加（P<0.05,P<0.01）。3.2 GABA对AD小鼠脑组织Aβ沉积的影响:与野生对照组小鼠相比,AD模型组与AD干预组小鼠脑组织Aβ沉积个数明显升高（P<0.05,P<0.01）;与AD模型组小鼠相比,AD干预组小鼠脑组织Aβ沉积个数明显减少（P<0.01）。3.3 GABA对AD小鼠脑组织NEP表达的影响:与野生对照组小鼠相比,AD模型组小鼠脑组织NEP表达下降（P<0.01）;与AD模型小鼠相比,AD干预组小鼠脑组织NEP表达上升（P<0.01）。3.4 GABA对AD小鼠脂肪组织LPL、脑微血管内皮细胞LPL表达的影响:与野生对照组小鼠相比,AD模型组小鼠脂肪组织NEP、脑微血管内皮细胞LPL表达均下降（P<0.01）;对AD模型小鼠相比,AD干预组小鼠脂肪组织LPL及脑微血管内皮细胞LPL表达显著上升（P<0.01）。3.5 GABA对AD模型小鼠脑组织、脂肪组织HDAC1/2/3表达的影响:与野生对照组小鼠相比,AD模型组小鼠脑组织、脂肪组织HDAC1/2/3表达升高（P<0.01）;对AD模型小鼠相比,AD干预组小鼠脑组织、脂肪组织HDAC1/2/3表达均下降（P<0.01）;与野生对照组小鼠相比,AD模型组小鼠脑组织、脂肪组织Ace-H3K9、Ace-H4K12表达下降（P<0.01）;对AD模型小鼠相比,AD干预组小鼠脑组织、脂肪组织Ace-H3K9、Ace-H4K12表达升高（P<0.01）。结论:GABA通过非受体途径抑制HDACs;GABA拮抗AD作用可能与其抑制HDACs进而调节AD脑内NEP及脂肪组织LPL表达有关。