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颗粒蛋白前体(Progranulin,PGRN)是一种分泌性糖蛋白,又被称为granulin-epithelin precursor(GEP),proepithelin(PEPI),acrogranin 和 GP88/PC-cell derived growth factor(PCDGF)。PGRN是一个由593个氨基酸组成的自分泌生长因子,蛋白分子量约为68 kDa。PGRN包括7.5个富含半胱氨酸的重复结构域,它们以P-G-F-B-A-C-D-E的顺序排列,其中A-G包含一个完整的重复序列结构域,而P仅包含半个结构域。PGRN广泛分布于富含上皮细胞的组织、器官和系统如皮肤、肾、脾和生殖系统等。PGRN具有促进细胞增殖、抗炎、伤口修复等生理功能,同时也参与肿瘤、脂类代谢性疾病及神经退行性疾病等病理过程。但目前其确切的生物学分子机制尚不清楚,由于蛋白发挥其功能多数是通过与其相互作用的蛋白来实现的,因此,研究PGRN相互作用蛋白的功能对阐明其生物学功能的分子机制有重要意义。通过酵母双杂交系统,本实验室前期的研究筛选出了与PGRN相互作用的分子ARID5A,且使用免疫共沉淀、GST-pull down等技术进一步验证了两分子的相互作用。ARID5A(AT-rich interactive domain-containing protein 5a)首次被发现于未分化的胚胎肿瘤细胞Tera-2和THP-1细胞核提取物中,它可以与人巨细胞病毒M-IE(Major immediate early)基因增强子上游的一段DNA序列结合,抑制基因表达。已有研究表明,ARID5A不仅可以与DNA结合,还可以和一些受体、转录因子甚至mRNA结合,并在不同生理及病理过程中发挥重要的功能。本课题旨在通过研究PGRN对ARID5A参与的雌激素受体介导的转录激活作用的影响及ARID5A对HEK293和MCF-7细胞增殖的影响,为阐明PGRN生物学功能的分子机制奠定基础。本课题主要分为三个部分,第一部分是针对ARID5A N端功能结构域单克隆抗体的制备,为后续检测ARID5A敲除细胞系和对其功能的进一步研究奠定了基础;第二部分是ARID5A敲除的HEK293和MCF-7细胞系的建立;第三部分是PGRN与ARID5A相互作用的功能研究,初步探索了 PGRN和ARID5A相互作用对雌激素受体介导的转录激活作用的影响及对HEK293和MCF-7细胞增殖的影响,从而为进一步阐明其作用的分子机制奠定了基础。本课题具体的研究内容包括以下几个方面:1.针对ARID5A N端功能结构域的单克隆抗体制备:将实验室前期克隆的ARID5A N端结构域ARID5A-N序列连入pET28a原核表达载体中,在BL21(DE3)中表达ARID5A-N原核蛋白,将蛋白进行纯化后免疫Balb/c小鼠,经过杂交瘤融合和筛选,制备获得了 8株针对ARID5A-N的单克隆抗体,并通过免疫共沉淀、细胞免疫染色等方法对8株单克隆抗体进行了鉴定。2.ARID5A敲除的HEK293及MCF-7细胞系的建立:设计针对ARID5A的4对sgRNA,将其连入实验室构建的sgRNA表达载体,将其与Cas9表达载体共同转染HEK293,检测其打靶效率,最后选用打靶效率较高的sgRNA3进行后续实验;构建用于同源重组的含有打靶区域上下游同源臂的打靶载体,将其与Cas9和sgRNA3表达载体分别共同转染HEK293及MCF-7细胞系,通过筛选以及克隆化,最终获得了 ARID5A双等位基因敲除(ARID5A-/-)的HEK293细胞系及ARID5A单等位基因敲除(ARID5A+/-)的MCF-7细胞系。然后分别通过PCR、测序和western blot的方法对上述细胞系进行了进一步鉴定。3.PGRN和ARID5A相互作用对雌激素受体介导的靶基因转录激活作用的影响:分别在野生型HEK293和ARID5A敲除的HEK293细胞系中转染ARID5A和PGRN表达载体以及用于检测雌激素效应的双荧光素酶报告系统相关载体,然后通过检测荧光素酶报告基因的活性,初步探究了 PGRN与ARID5A相互作用对ERα介导的转录激活作用的影响。实验结果显示,ARID5A能够抑制ERα介导的转录激活作用,而PGRN能够拮抗这种抑制作用,因此提示,PGRN对ERα转录激活作用的调控是通过ARID5A介导实现的。4.PGRN和ARID5A相互作用对HEK293和MCF-7细胞增殖的影响:在ARID5A双等位基因敲除的HEK293和ARID5A单等位基因敲除的MCF-7细胞中通过MTT法检测PGRN与ARID5A对细胞增殖的影响。实验结果表明,ARID5A过表达能够抑制HEK293细胞的增殖,而PGRN能够对这种抑制作用造成逆转;在ARID5A敲除的HEK293细胞系中的实验结果表明,ARID5A的敲除可以促进HEK293细胞增殖,PGRN对HEK293细胞增殖的促进作用一定程度上依赖于ARID5A;此外,ARID5A过表达能够抑制MCF-7细胞的增殖,ARID5A单等位基因敲除对MCF-7细胞增殖有促进作用。综上所述,本课题共获得了如下实验结果:(1)成功制备了 8株针对ARID5A N端功能结构域的单克隆抗体。经过Western blot及细胞免疫染色等方法对所制备的单抗进一步的鉴定表明,所制备的抗体为后续ARID5A功能实验研究提供了有效的工具;(2)利用Cas9-sgRNA技术构建并获得了 ARID5A双等位基因敲除(ARID5A-/-)的HEK293细胞系及ARID5A单等位基因敲除(ARID5A+/-)的MCF-7细胞系;(3)在野生型HEK293及ARID5A敲除的HEK293细胞系中验证了 ARID5A对ERα的转录激活作用的抑制作用,并证实PGRN可以通过与ARID5A相互作用拮抗这种抑制作用;(4)PGRN对ARID5A介导的HEK293细胞增殖的抑制作用的逆转部分依赖于ARID5A;(5)ARID5A对MCF-7细胞增殖具有抑制作用。