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目的本课题旨在研究谷氨酰胺在急性酒精性肝损伤中所起的作用及分子机制方法(一)动物实验:健康清洁C57BL/6雄性小鼠40只,正常喂养后随机分为正常对照组(10只)、酒精组(10只)、谷氨酰胺+酒精组(10只)、谷氨酰胺+酒精+PDTC(NFκB抑制剂)组(10只):正常对照组连续七天每天给与蒸馏水灌胃后灌入与白酒等量体积蒸馏水和腹腔注射与PDTC等量生理盐水;酒精组连续七天每天给与蒸馏水灌胃,酒精灌胃前30min,腹腔注射与PDTC等量生理盐水然后使用56度白酒(24m L/kg)灌胃;谷氨酰胺+酒精组连续七天每天给与L-谷氨酰胺(100mg/kg)溶于蒸馏水灌胃,酒精灌胃前30min,腹腔注射与PDTC等量生理盐水,然后使用56度白酒(24m L/kg)灌胃后腹腔注射与PDTC等量生理盐水;谷氨酰胺+酒精+PDTC(NFκB抑制剂)组连续七天每天给与L-谷氨酰胺(100mg/kg)溶于蒸馏水灌胃然,酒精灌胃前30min,腹腔注射PDTC(120mg/kg后使用56度白酒(24m L/kg)灌胃。在24小时后脱颈处死(禁止饮食)。收集眼球血清检测谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和肝脏指数情况;苏木精和伊红染色(HE染色)观察小鼠肝组织受损情况;过碘酸希夫染色试验来观察小鼠肝糖原变化情况;天狼猩红染色后观察小鼠肝纤维变化;Hoechst33258染料染色后荧光显微镜观察肝细胞凋亡情况;细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase3,热应激蛋白70(HSP70),细胞色素CYP2E1,NFκB通路相关蛋白IκBα、NFκB-p65,TNF-α的免疫印迹检测。(二)细胞实验:正常肝细胞L02常规培养后分为四组,正常对照组:正常培养长满细胞后换入无谷氨酰胺培养基培养24小时;酒精组:正常培养长满细胞后换入无谷氨酰胺和酒精浓度为30ul/ml的培养基培养24小时;谷氨酰胺+酒精组:正常培养长满细胞后换入谷氨酰胺浓度0.01mol/L和酒精浓度为30ul/ml的培养基培养24小时;谷氨酰胺+酒精+PDTC组:正常培养长满细胞后换入谷氨酰胺浓度0.01mol/L、PDTC浓度为20umol/L和酒精浓度为30ul/ml的培养基培养24小时。CCK-8细胞活性增殖检测;免疫印迹检测相关蛋白表达:细胞凋亡相关蛋白Caspase-3,热应激蛋白70(HSP70),细胞色素CYP2E1、IκBα、NFκB-p65。结果动物实验:1.谷丙、谷草转氨酶结果以及肝脏指数情况:谷氨酰胺+酒精组和谷氨酰胺+酒精+PDTC组较酒精组小鼠血清中谷草转氨酶、谷丙转氨酶水平以及肝脏指数显著降低(P<0.05或P<0.01)而酒精组较正常对照组则显著升高(P<0.05或P<0.01),其中谷氨酰胺+酒精+PDTC组较谷氨酰胺+酒精组则是降低(P<0.05),但是肝脏指数却不明显(P>0.05),表明谷氨酰胺显著减轻了酒精诱导的小鼠急性肝损伤程度,与PDTC组的趋势相同;2.苏木精-伊红染色结果:谷氨酰胺+酒精组和谷氨酰胺+酒精+PDTC组较酒精组小鼠肝损伤程度减轻(P<0.05),而酒精组较正常对照组小鼠出现明显的肝损伤现象(P<0.01),表明谷氨酰胺减轻了酒精诱导的急性肝损伤,与PDTC组的趋势相同;3.过碘酸希夫染色法染色结果:谷氨酰胺+酒精组和谷氨酰胺+酒精+PDTC组较酒精组肝脏糖原明显增加(P<0.01)而酒精组较正常对照组肝脏糖原明显减少(P<0.01),其中谷氨酰胺+酒精+PDTC组较谷氨酰胺+酒精组则增加(P<0.05)表明是由于谷氨酰胺缓解了肝损伤减少了肝糖原损失且与PDTC组趋势相同;4.天狼猩红染色结果:谷氨酰胺+酒精组和谷氨酰胺+酒精+PDTC组较酒精组小鼠肝纤维化程度明显减轻(P<0.01)而酒精较正常对照组则显著增加(P<0.01),表明谷氨酰胺能够抑制肝纤维化进展;5.Hoechst33528染色结果:谷氨酰胺+酒精组和谷氨酰胺+酒精+PDTC组较酒精组肝细胞凋亡率显著下降(P<0.01)而酒精组较正常对照组肝细胞出现了明显的凋亡现象(P<0.01),其中谷氨酰胺+酒精+PDTC组较谷氨酰胺+酒精组则下降更明显(P<0.05)表明谷氨酰胺能够减少肝细胞凋亡,与PDTC组趋势相同;6.蛋白印迹结果:谷氨酰胺+酒精组和谷氨酰胺+酒精+PDTC组较酒精组小鼠肝细胞Bax,Caspase-3,CYP2E1,NFκB-p65和TNF-α的表达含量明显减少(P<0.01)而酒精组较正常对照组表达含量则显著增加(P<0.01),其中谷氨酰胺+酒精+PDTC组较谷氨酰胺+酒精组表达含量则减少(P<0.05)。谷氨酰胺+酒精组和谷氨酰胺+酒精+PDTC组较酒精组小鼠肝细胞Bcl-2,IκBα的蛋白表达量显著增加(P<0.05或P<0.01)而酒精组较正常对照组则显著减少(P<0.01),其中谷氨酰胺+酒精+PDTC组较谷氨酰胺+酒精组则显著增加(P<0.05)。谷氨酰胺+酒精组和谷氨酰胺+酒精+PDTC组较酒精组小鼠肝细胞HSP70的蛋白表达量显著增加(P<0.01),而酒精组较正常对照组显著增加,其中谷氨酰胺+酒精+PDTC组较谷氨酰胺+酒精组表达含量无明显差异(P>0.05)。NFκB-p65是NFκB信号通路激活的标志物IκBα是NFκB信号通路抑制的标志物,我们的结果表明:谷氨酰胺通过抑制NFκB信号通路减轻酒精诱导的小鼠急性肝损伤;细胞实验:1.CCK-8结果显示:谷氨酰胺+酒精组、谷氨酰胺+酒精+PDTC组较酒精组肝细胞生存率显著升高(P<0.01)而酒精组较正常对照组肝细胞生存率明显降低(P<0.01),其中谷氨酰胺+酒精+PDTC组的生存率比谷氨酰胺+酒精组高(P<0.05)说明谷氨酰胺能够显著提高细胞生存率且与PDTC组趋势相同;2.蛋白印迹结果:谷氨酰胺+酒精组和谷氨酰胺+酒精+PDTC组较酒精组细胞HSP70的蛋白表达量明显增加(P<0.01),酒精组较正常对照组明显增加(P<0.05),其中谷氨酰胺+酒精+PDTC组较谷氨酰胺+酒精无统计学差异(P>0.05)。谷氨酰胺+酒精组和谷氨酰胺+酒精+PDTC组较酒精组细胞IκBα的蛋白表达量明显增加(P<0.05或P<0.01)而酒精组较正常对照组明显减少(P<0.01),其中谷氨酰胺+酒精+PDTC组较谷氨酰胺+酒精组也是明显增加(P<0.05)。谷氨酰胺+酒精组和谷氨酰胺+酒精+PDTC组较酒精组细胞Caspase-3,CYP2E1,NFκB-p65的蛋白表达量明显减少(P<0.05或P<0.01),而酒精组较正常对照组显著增加(P<0.01),其中谷氨酰胺+酒精+PDTC组较谷氨酰胺+酒精组则显著减少(P<0.05),表明谷氨酰胺能够减轻酒精诱导的肝细胞损伤且与NFκB信号通路相关。结论谷氨酰胺能够通过调控NFκB信号通路减轻酒精诱导的小鼠急性肝损伤。